二（噻吩-2-基）-1,2,4-三嗪衍生物作为多激酶抑制剂和抗癌剂的研究

《Journal of Molecular Structure》：Study of di- (thiophene-2-yl)-1,2,4-triazine derivatives as multikinase inhibitors and anticancer agents

1,2,4-三嗪衍生物抗癌活性及多激酶抑制机制研究，评估S1-S15化合物对K562、HT-29、BT-549细胞的增殖抑制，发现S7、S8、S12活性显著，S12在10 μM下抑制FLT3、MET等激酶，诱导细胞周期阻滞和凋亡，分子对接及DFT分析验证其多靶点机制。

　　

Motahareh Mortazavi|Najmeh Edraki|Marjan Tavakkoli|Somaye Karimian|Luciano Saso|Omidreza Firuzi

伊朗设拉子医科大学医学科学学院药物与天然产物化学研究中心

摘要

受体酪氨酸激酶是致癌信号传导的关键驱动因素，这一特性使它们成为抗癌药物发现的主要靶点。本研究探讨了15种二-(噻吩-2-基)-1,2,4-三嗪衍生物（S1-S15）作为抗癌剂和多激酶抑制剂的潜力。通过MTT实验评估了这些化合物对K562、HT-29和BT-549癌细胞的抗增殖作用。使用放射性方法对S7、S8和S12与32种致癌激酶的相互作用进行了分析。通过碘化丙啶流式细胞术测定了这些衍生物对细胞周期分布的影响，而凋亡诱导作用则通过Annexin V/碘化丙啶方法进行评估。含有3-硝基苯基、4-硝基苯基和4-吡啶基团并与肼基团连接的S7、S8和S12衍生物表现出显著的抗增殖活性。其中，S12在10 μM浓度下对FLT3、FLT4（VEGFR3）、MET、NTRK1-3（TRKA、B和C）表现出明显的抑制作用。此外，S12还能增加BT-549细胞的亚G1期细胞周期比例并诱导细胞凋亡，同时对非癌细胞影响较小。分子对接研究证实了S12与FLT3、FLT4、MET和NTRK1活性位点关键残基的相互作用，这种作用由氢键和疏水接触介导。密度泛函理论（DFT）分析进一步揭示了与分子反应性和稳定性相关的电子特性。这些发现表明二-(噻吩-2-基)-1,2,4-三嗪衍生物是开发多激酶靶向抗癌疗法的有希望的候选分子。

引言

癌症是一组由细胞异常增生引起的疾病，目前仍是全球第二大死亡原因，仅次于心血管疾病。2022年全球新增癌症病例接近2000万例，死亡人数达970万，凸显了癌症作为全球主要健康挑战的地位[1,2]。据估计，大约五分之一的人在其一生中会患上癌症，其中九分之一的男性和十二分之一的女性会因此死亡[1]。预计到2050年，癌症带来的健康负担将大幅增加，每年新增病例数将达到约3500万例，比2022年增加75%以上[3]。全球癌症负担及其经济影响强调了加快研发更好治疗方案的紧迫性[4]。

对癌症分子驱动因素的深入了解促进了分子靶向疗法的发展。靶向治疗包括小分子抑制剂和抗体，它们能够特异性阻断参与肿瘤发生的信号传导途径，其安全性和有效性远优于化疗[[5], [6], [7]]。

受体酪氨酸激酶（RTKs）是膜结合受体，是调控细胞增殖、存活和侵袭等癌症特征的关键因子，其异常激活在多种癌症的进展中起着重要作用[8,9]。因此，EGFR（表皮生长因子受体）、VEGFR-1/2/3（血管内皮生长因子受体1/2/3）、MET（间充质-上皮转化因子酪氨酸激酶）、FLT3（FMS样酪氨酸激酶受体3）、NTRK1/2/3（神经营养性肌球蛋白受体激酶）等RTKs被视为有前景的癌症分子靶点[10]。二十年来，激酶抑制剂已成为靶向治疗的重要支柱。

许多获得FDA批准的癌症治疗用激酶抑制剂，如苏尼替尼、索拉非尼、瑞戈非尼和卡博替尼等，都属于多激酶抑制剂[11]。虽然选择性小分子激酶抑制剂仅对一种或少数几种特定激酶起作用，但多激酶抑制剂可以同时抑制多个信号通路[12]。这一特性可能对这些药物具有优势，因为许多癌症中常常观察到多种激酶的失调。此外，抑制某些激酶可能会伴随其他激酶的激活，这可能是从一开始就使用多激酶抑制剂的原因之一。最后，多激酶抑制剂能够靶向“旁路”信号通路。例如，二线治疗的苏尼替尼和三线治疗的瑞戈非尼被用于伊马替尼耐药的胃肠道肿瘤[11,13]。此外，也有报道显示同时靶向EGFR/VEGFRs[14]、FGFRs/VEGFRs[15]和MET/VEGFRs[16]的双重靶向疗法比单一靶向疗法更有效。

多激酶抑制剂通常含有富氮杂环[[17], [18], [19], [20]]。特别是含有[1,2,4]三嗪结构的氮杂环，在avapritinib、brivanib和capmatinib等激酶抑制剂中十分突出，这些抑制剂在恶性肿瘤治疗中显示出显著疗效[17,[21], [22], [23], [24]]。此外，基于噻吩的衍生物是具有多种药理活性的化合物，包括抗癌、抗菌、抗炎和抗氧化作用等[[25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]]。

已有报道指出，含有1,2,4-三嗪和噻吩结构的多种多激酶抑制剂化合物具有强抗癌活性。例如，Ma及其同事报道了Thio-Iva（图1，化合物A），这是一种含噻吩的多激酶抑制剂，对VEGFR-2具有选择性活性，在肝细胞癌（HCC）细胞中表现出强烈的抗肿瘤和抗血管生成作用。Thio-Iva在Huh-7和SNU-449肝细胞癌细胞中显示出强烈的抗增殖作用，通过ROS介导的途径导致G2/M期停滞和细胞凋亡[32]。Alotaibi及其同事引入了化合物B（图1，化合物B），这是一种噻吩取代的吡咯[2,3-d]嘧啶衍生物，可作为EGFR、HER2、VEGFR2和CDK2的多激酶抑制剂，同时诱导细胞周期停滞、促进细胞凋亡并上调促凋亡蛋白Bax[33]。Abdo及其同事描述了一种1,2,4-三嗪-噻吩-肼衍生物（图1，化合物C），其在纳摩尔浓度（IC₅₀：0.23–1.03 nM）下对多种酪氨酸激酶（MET、KIT、FLT3、VEGFR2、EGFR、PDGFR）具有强抑制作用，并在多种癌细胞系中表现出强烈的抗增殖效果[34]。El-Wakil等人研究了化合物D（图1，化合物D），这是一种磺酰基酰肼-1,2,4-三嗪衍生物，对A549、HT-29和MKN-45细胞系表现出强烈的MET抑制作用（IC₅₀ = 4.31 μM）和高细胞毒性[35]。

基于上述发现，1,2,4-三嗪和噻吩类生物活性化合物似乎与多种激酶的活性位点有很强的相互作用潜力。1,2,4-三嗪骨架能够与ATP结合口袋内的关键残基形成氢键和π–π堆叠，而亲脂性的噻吩环则在结合位点的非极性区域促进疏水相互作用和π–π相互作用，可能还有助于提高膜通透性。此外，肼基连接器作为1,2,4-三嗪核心和芳基之间的灵活桥梁，通过氢键形成促进电子相互作用。

在本研究中，我们基于这些化合物与已知多激酶抑制剂的结构相似性，探讨了含有肼基的二-(噻吩-2-基)-1,2,4-三嗪衍生物的抗癌潜力。这些化合物此前已被报道为抗阿尔茨海默病药物[36]，本研究重新利用它们并评估了它们对不同癌细胞系的抗癌活性。还对最有前景的化合物的抑制活性进行了评估，并研究了它们在诱导细胞凋亡和改变细胞周期中的作用。此外，还进行了密度泛函理论（DFT）计算，包括前线分子轨道和静电势分析，以将设计分子的电子特性与其激酶抑制作用相关联。

二-(噻吩-2-基)-1,2,4-三嗪衍生物的制备与表征

本研究中研究的十五种二-(噻吩-2-基)-1,2,4-三嗪衍生物之前已在文献中合成并报道[36]。合成路线（包括反应条件和纯化步骤）以及特征光谱数据（IR、1H NMR、13C NMR和MS）详见引用文献。为便于理解，合成路线的总结及所有化合物的完整光谱数据包含在补充信息中。

通过MTT实验评估抗增殖作用

对癌细胞的抗增殖作用

我们通过MTT实验评估了合成化合物（S1-S15）对三种不同癌细胞系（K562（人类慢性髓性白血病）、HT-29（人类结直肠腺癌）和BT-549（人类乳腺导管癌）的抗增殖作用。

需要考虑特定癌细胞系对不同激酶靶点的依赖性。换句话说，必须注意在某种癌细胞系中靶向特定激酶是否会影响...

结论

本研究评估了十五种二-(噻吩-2-基)-1,2,4-三嗪衍生物作为多激酶抑制剂和抗癌剂的潜力。使用MTT实验体外评估了化合物< />-S15对三种人类癌细胞系K562、HT-29和BT-549的抗增殖活性。结果表明，大多数化合物对所有三种癌细胞系都表现出显著的抗增殖作用，IC₅₀值低至0.4 μM。最有前景的衍生物是...

CRediT作者贡献声明

Motahareh Mortazavi：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，数据分析。Najmeh Edraki：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，软件应用，资源管理，项目协调，方法学研究，资金获取，数据分析，概念化。Marjan Tavakkoli：方法学研究，数据分析。Somaye Karimian：撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢设拉子医科大学研究副校长的支持（资助编号：15457）。