《Journal of Molecular Structure》：Interaction of a Novel Antibacterial and Analgesic Ionic Liquid, 8-Caffeinyl Piperazinyl Salicylate, with Human Serum Albumin: Insights from Fluorescence Spectroscopy and Molecular Dynamics
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人类血清白蛋白（HSA）与新型离子化合物8-PCSal的相互作用机制通过光谱与计算研究得到揭示，显示静态淬灭主导的氢键及范德华相互作用，结合分子对接与动态模拟确定Sudlow sites I和II为优势结合位点，证实HSA作为药物载体调节8-PCSal药效的潜力。
Golshan Golshanian|Mohammad Mehdi Alavianmehr|Mohammad Navid Soltani Rad|Delara Mohammad-aghaie|Somayeh Behrouz|Mohsen Sorouri
伊朗设拉子理工大学化学系，设拉子 71555-313
摘要
人血清白蛋白（HSA）是血浆中主要的蛋白质，负责药物的运输，其与小分子的相互作用在药代动力学调节中起着关键作用。在本研究中，使用了一种具有良好镇痛和抗菌特性的离子化合物8-咖啡酰哌嗪基水杨酸盐（8-PCSal），通过光谱和计算方法系统地研究了其与HSA的相互作用。稳态荧光淬灭实验表明，这种相互作用属于自发静态淬灭机制，这从Stern–Volmer常数和结合常数的温度依赖性降低中可以得到验证，表明其结合亲和力适中。热力学分析显示，结合过程是自发的（ΔG < 0）且放热的（ΔH < 0），同时伴随着熵变减少（ΔS < 0），这与通过氢键和范德华力稳定的有序蛋白质-配体复合物的形成一致。紫外-可见光吸收光谱提供了配体对芳香残基微环境影响的补充证据。自由HSA和HSA-8-PCSal复合物的傅里叶变换红外（FT-IR）光谱显示，在酰胺I和酰胺II区域存在微妙但可重复的变化，反映了配体引起的微环境扰动，同时HSA的整体二级结构基本保持不变。分子对接研究显示8-PCSal优先结合在Sudlow位点I和II。使用GOLD对接完整的离子对时，发现位点I（亚结构域IIA）是最有利的结合区域；而AutoDock Vina预测阳离子形式的配体结合在位点II（亚结构域IIA）。在接近生理条件的100纳秒时间尺度上进行的分子动力学模拟证实了蛋白质的构象稳定性，为解释配体结合行为提供了结构参考。这些发现突显了白蛋白作为治疗用离子液体载体的潜力，并提供了关于8-PCSal分布和药理行为的分子层面见解。
引言
人血清白蛋白（HSA）是人体血浆中最丰富的蛋白质，约占血浆总蛋白含量的50–60%，分子量为约66 kDa [1]。由于其高浓度和多样的功能，HSA是生理稳态的关键调节因子。它在维持血管液体平衡、运输和缓冲各种生理和药理物质以及提供抗氧化和缓冲功能方面起着关键作用。此外，血清白蛋白还被广泛用作肝功能及营养状态的临床指标 [2]。
白蛋白水平的变化会对液体稳态、药物分布和整体健康产生深远影响 [3]。HSA最重要的生理功能之一是维持胶体渗透压（ Oncotic pressure），防止血浆渗漏，减少水肿形成，并调节血管腔与周围组织之间的液体交换 [4]。这些特性解释了HSA在生存中的不可或缺的作用，以及其在烧伤、休克、败血症和低白蛋白血症等临床条件下的治疗应用 [5]。除了液体调节外，HSA还通过清除活性氧和氮物种表现出抗氧化活性，从而保护组织免受氧化应激，尤其是在病理条件下。
除了其生理重要性外，HSA还作为一种多功能载体蛋白，能够结合和运输脂肪酸、胆红素、激素以及众多内源性和外源性药物 [6][7][8]。其高丰度、较长的循环半衰期（约19天）以及多个配体结合位点的存在，使其成为药物递送应用的理想平台 [9][10][11][12]。从结构上看，HSA由三个同源结构域（I、II和III）组成，每个结构域又进一步划分为亚结构域A和B [12,13]。两个主要的药物结合位点，即Sudlow位点I和II，分别位于亚结构域IIA和IIA，负责结合多种内源性和外源性配体 [14,15]。这些位点上的相互作用显著影响关键的药代动力学参数，包括药物分布、生物利用度、血浆半衰期、清除率和分布容积 [16,17]。图1展示了HSA结构域的组织结构，X射线晶体学确定了其三结构域架构 [18]。
最近的研究广泛使用光谱、色谱和计算方法研究了HSA与配体的相互作用 [19,20]。例如，抗抑郁药和抗焦虑药如舍曲林和丁螺环酮已被报道能够自发结合到HSA上，并引起蛋白质结构的可检测构象变化 [21]。关于合成大麻素的研究进一步表明，它们在Sudlow位点I具有极高的结合亲和力，并受到华法林和布洛芬等经典位点标记物的竞争性和别构调节。同时，先进的计算方法（包括通过配体竞争饱和度进行位点识别，SILCS）提供了HSA结合景观的高分辨率映射，并详细揭示了配体-蛋白质识别机制 [22]。除了结构表征外，多项研究强调了HSA在药物运输和递送中的积极作用，突显了其作为多功能治疗载体的潜力 [23,24]。
在本研究中，我们探讨了一种新型离子化合物8-咖啡酰哌嗪基水杨酸盐（8-PCSal，图2）与人血清白蛋白（HSA）的相互作用。通过荧光、紫外-可见光和红外光谱以及分子动力学模拟和分子对接方法系统地研究了这种相互作用。这种综合方法使我们能够确定结合亲和力和热力学参数，评估蛋白质的构象稳定性，并识别HSA内的优先结合位点。
材料与方法
HSA（纯度99.8%，CAS编号：9048-46-8）及其他所需化学品均从Merck公司购买。8-PCSal的合成方法依据文献[25]进行。紫外-可见光和荧光测量分别使用Varian Cary 50 Conc和Varian Cary Eclipse荧光分光光度计完成。红外光谱测量使用配备ATR附件的Brüker FT-IR光谱仪进行。pH值调整使用Metrohm 744 pH计完成。
荧光淬灭
荧光发射强度的降低，通常称为淬灭，是一种高度敏感的分子相互作用检测方法。淬灭可能由蛋白质内的构象变化、浓度变化或高吸光度或光散射条件下的内部滤光效应引起 [41]。如图3(a)所示，主要存在两种淬灭机制：
结论
本研究采用综合的光谱、热力学和计算方法，全面探讨了药物离子液体8-PCSal与HSA之间的相互作用。稳态荧光淬灭分析表明，这种相互作用主要是静态淬灭机制，这从Stern–Volmer常数（Ksv）和结合常数（Ka）随温度升高而系统降低的现象得到证实，同时伴随着双分子淬灭速率常数的变化。
CRediT作者贡献声明
Golshan Golshanian：概念提出、方法设计、实验实施、数据管理、形式分析、可视化、初稿撰写。Mohammad Mehdi Alavianmehr：方法设计、验证、实验研究（分子对接和分子动力学）、审稿与编辑、资金获取。Mohammad Navid Soltani Rad：概念提出、撰写-审稿与编辑、资金获取。Delara Mohammad Aghaie：方法设计、验证、实验研究（包括分子对接的物理化学方面）
CRediT作者贡献声明
Golshan Golshanian：初稿撰写、可视化、方法设计、数据管理、概念提出。Mohammad Mehdi Alavianmehr：可视化、监督、方法设计、概念提出。Mohammad Navid Soltani Rad：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、可视化、监督、项目管理、实验研究、概念提出。Delara Mohammad-aghaie：初稿撰写、软件应用、方法设计、实验研究、形式分析。Somayeh Behrouz：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢设拉子理工大学提供的实验室设施和计算资源。
