通过RNA自噬降解α-突触核蛋白（SNCA）mRNA

α-突触核蛋白mRNA通过SIDT2介导的RNA自噬降解，其5'非翻译区G富集序列是关键识别位点，该机制对路易体疾病病理有潜在调控意义。

　　

Chihana Kabuta|Fumihiko Hakuno|Naoyuki Kataoka|Shin-Ichiro Takahashi|Tomohiro Kabuta

日本东京小平町大川东4-1-1，国立神经科学研究所，国家神经病学与精神病学中心，退行性神经疾病部门，邮编187-8502

摘要

<α-突触核蛋白是一种神经元蛋白，也是路易小体的主要成分，而路易小体是帕金森病和路易小体痴呆等疾病的病理特征。虽然α-突触核蛋白在神经元中的积累与这些疾病的发病机制有关，但其mrna降解的机制仍不甚清楚。rnautophagy是一种溶酶体rna降解途径，其中rna直接被摄取到溶酶体中并随后被降解。sidt2是一种溶酶体膜蛋白，介导rna的摄取。在这项研究中，我们探讨了sidt2介导的rnautophagy是否能够降解α-突触核蛋白mrna。敲低sidt2会导致α-突触核蛋白mrna的降解减少，而野生型sidt2的过表达则会增强其降解，这表明sidt2在α-突触核蛋白mrna的周转中起作用。相比之下，rna摄取缺陷的s564a突变体的过表达并未增强降解，表明rna摄取活性对于sidt2介导的α-突触核蛋白mrna降解是必需的。通过一系列缺失突变体的分析，我们确定了α-突触核蛋白mrna 5′非翻译区（5′-utr）中的一个富含鸟嘌呤（g）的序列是sidt2依赖性降解的关键决定因素。此外，将这种富含g的序列插入gfp mrna的5′-utr中可以促进gfp>

引言

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大多数帕金森病病例是散发的（90–95%）。在散发型帕金森病中，由于环境或遗传因素导致的α-突触核蛋白错误折叠被认为会形成纤维结构（Breydo等人，2012年）。在此过程中产生的可溶性寡聚体，包括原纤维，被认为具有毒性并可能导致细胞死亡（Cascella等人，2021年；Chen等人，2015年；Lindstrom等人，2014年）。因此，α-突触核蛋白或mRNA水平的升高可能是路易小体疾病的风险因素，研究α-突触核蛋白水平的调控机制可能为这些疾病的病理提供重要见解，并有助于开发新的治疗方法。事实上，一些研究报道，在死后检查的帕金森病患者大脑中α-突触核蛋白mRNA水平升高（Gründemann等人，2008年；Murphy等人，2015年），这提示mRNA的产生或降解失调可能参与了疾病病理。最近的研究强调了转录后调控在控制α-突触核蛋白表达中的重要性。α-突触核蛋白mRNA 5′和非翻译区（UTRs）中的调控元件影响其翻译和稳定性（稍后讨论）。迄今为止，α-突触核蛋白mRNA降解的机制仍大部分未被探索。

RNautophagy是一种RNA降解过程，其中溶酶体以ATP依赖的方式直接摄取RNA并随后将其降解（Contu等人，2023年；Fujiwara等人，2013年）。这一过程在机制上不同于巨自噬。我们之前已经证明，溶酶体膜蛋白SIDT2在RNautophagy过程中介导RNA进入溶酶体（Aizawa等人，2016年）。SIDT2是一种11次跨膜蛋白，据认为具有水解酶活性，尽管其内源性底物尚不清楚（Qian等人，2023年；Sun等人，2024年）。SIDT2的敲低显著抑制了培养细胞中细胞内总RNA的溶酶体降解，而其过表达则显著增强了RNA降解（Aizawa等人，2016年；Contu等人，2017年），表明多种RNA可以通过SIDT2介导的RNautophagy被降解。此外，SIDT2蛋白水平与α-突触核蛋白水平相关，并在帕金森病和路易小体痴呆（DLB）患者的死后大脑中与磷酸化的α-突触核蛋白聚集物共定位，这表明SIDT2与α-突触核蛋白之间存在病理联系。这些发现提示α-突触核蛋白mRNA可能是这一途径的底物。在这项研究中，我们探讨了α-突触核蛋白mRNA是否确实通过SIDT2介导的RNautophagy被降解。

实验片段

siRNAs

针对EGFP的siRNAs（siCtrl作为对照，靶序列：5′-CAGCACGACUUCUUCAAGU-3′）、小鼠Sidt2的siRNAs（siSIDT2-A，靶序列：5′-GAGUUUCCGUCCAGUAUUU-3′）和小鼠Sidt2的siRNAs（siSIDT2-B，靶序列：5′-GUUCUGUGUUAGUCACGUA-3′）购自Japan Bio Services。除非另有说明，否则使用siSIDT2-A进行小鼠Sidt2敲低实验。针对人类SIDT2的siRNA使用的是MISSION esiRNA（Sigma-Aldrich，EHU073391）。MISSION esiRNA是一组异质性的siRNAs

SIDT2敲低抑制MEFs中内源性α-突触核蛋白mRNA的降解

我们之前已经报道，SIDT2的敲低显著抑制了MEFs中细胞内RNA的溶酶体降解（Aizawa等人，2016年）。为了探讨SIDT2介导的RNautophagy是否能够降解α-突触核蛋白mRNA，我们使用放线菌素D（ActD）追踪实验评估了SIDT2敲低对MEFs中α-突触核蛋白mRNA降解速率的影响（图1A和B）。作为对比，我们还评估了其对编码β-actin（Actb）的mRNA以及两种参与神经退行性疾病的蛋白质的影响

讨论

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CRediT作者贡献声明

Shin-Ichiro Takahashi：撰写 – 审稿与编辑，监督。Naoyuki Kataoka：撰写 – 审稿与编辑，监督。Tomohiro Kabuta：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，项目管理，资金获取，概念构思。Chihana Kabuta：撰写 – 初稿撰写，数据可视化，实验设计，数据分析。Fumihiko Hakuno：撰写 – 审稿与编辑，监督

数据可用性

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利益冲突声明

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资助信息

本研究得到了日本学术振兴会（Japan Society for the Promotion of Science）的科学研究资助[19H05710（授予T.K.）和武田科学基金会（Takeda Science Foundation）的研究资助。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢东京大学的Noboru Mizushima博士提供Atg5+/+和Atg5–/–的MEFs，以及NCNP的Yoko Hara在分子生物学实验中的技术协助。同时，我们也感谢Editage（www.editage.jp）提供的英语语言编辑服务。