《Journal of Integrative Plant Biology》：Tandemly duplicated TaERF109 genes confer drought tolerance and post-drought recovery in wheat
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本综述聚焦于串联复制基因TaERF109家族在小麦应对干旱胁迫及旱后恢复中的核心调控机制。研究系统揭示了TaERF109A2通过直接激活细胞分裂素(CK)合成基因TaIPT8-5B/5D并上调烟胺(NAS)表达，协同下游MADS-box转录因子TaMADS56，整合调控小麦分蘖、抽穗期、铁毒耐受性及氧化还原平衡，从而显著提升干旱适应性与恢复能力。
TaERF109s是串联复制且对干旱高度响应的基因
为了识别干旱响应的串联复制基因(TDGs)并阐明小麦干旱适应的分子机制，研究者对遭受干旱胁迫和水分充足对照条件下的小麦植株进行了比较转录组分析。在鉴定的14,784个差异表达基因(DEGs)中，有1,210个被归类为TDGs。通过设定变化倍数和错误发现率(FDR)校正的阈值，研究者优先选择了10个编码推定ERF109样转录因子的候选基因进行深入功能验证。对“中国春”品种的全基因组序列分析鉴定了10个分布在三个亚基因组上的TaERF109同源基因：染色体1A上有三个TDGs (TraesCS1A02G370400, TraesCS1A02G370600, TraesCS1A02G370700)，染色体1B上有三个 (TraesCS1B02G389700, TraesCS1B02G389800, TraesCS1B02G389900)，染色体1D上有四个 (TraesCS1D02G376500, TraesCS1D02G376600, TraesCS1D02G376700, TraesCS1D02G376800)。它们分别被命名为TaERF109A1–A3、TaERF109B1–B3和TaERF109D1–D4。通过PCR扩增失败以及对“Fielder”品种基因组组装的BLAST分析，发现TaERF109B2在“Fielder”品种中缺失。对145个标志性品种的公共基因组变异数据进行筛查发现，其中11个品种完全缺失TaERF109B2所在区域的基因型数据，而其他TaERF109同源基因未观察到这种缺失。这表明TaERF109B2的缺失导致了TaERF109基因的拷贝数变异，在不同六倍体小麦种质中，其拷贝数从9个到10个不等。
蛋白质结构域分析显示，所有10个TaERF109蛋白都含有一个保守的AP2结构域。同时，启动子序列分析在其各自启动子区域发现了多样的胁迫和激素响应顺式作用元件。为了研究TaERF109s是否对干旱、其他非生物胁迫和植物激素有响应，研究者使用针对10个TaERF109s的特异性引物，在“中国春”中进行了实时定量PCR分析。TaERF109A1、TaERF109A2、TaERF109B1、TaERF109B2、TaERF109D1、TaERF109D2和TaERF109D3的转录在干旱处理5分钟后被强烈诱导，在30分钟时达到峰值（诱导水平达200-500倍），随后恢复至基础水平。这些干旱响应的TaERF109s也对细胞分裂素6-苄氨基嘌呤处理显示出快速的转录激活。而TaERF109A2、TaERF109B1和TaERF109B2转录本在热胁迫4小时后显著上调。TaERF109A2对NaCl处理响应迅速，在30分钟出现瞬时诱导。在生长素、茉莉酸甲酯和脱落酸处理后，表达变化极小。在正常条件下，TaERF109s在各个组织中表达水平相对较低，无组织特异性。RNA原位杂交分析进一步证实了TaERF109A2在干旱胁迫后，在具有高细胞增殖活性的组织（包括幼叶、茎尖分生组织、分蘖芽和根分生组织）中的干旱响应表达。
TaERF109在其C端区域附近含有一个AP2结构域。为了评估其转录激活潜力，将全长TaERF109A2及其N/C端截短片段与GAL4 DNA结合域融合，并在酵母菌株Y2HGold中表达。全长TaERF109A2和含有AP2结构域的C端片段都激活了报告基因的表达，证实了它们的转录激活活性。通过在小麦叶肉原生质体中瞬时表达TaERF109A2-GFP融合构建体进行亚细胞定位研究，共聚焦显微镜显示TaERF109A2-GFP与细胞核标记物EHD4-mCherry完全共定位，表明TaERF109A2在细胞核中发挥作用。这些结果支持了TaERF109A2是一种核定位蛋白，很可能作为转录激活因子发挥作用的观点。
ERF109的串联基因复制事件可能发生在小麦族多样化过程中
基因组扫描和系统发育分析显示，大麦中有两个同源的ERF109基因座，节节麦中有四个同源基因座，都以串联阵列方式组织。相比之下，在其他单子叶植物物种（包括水稻、玉米、高粱、谷子和二穗短柄草）中只鉴定到单拷贝的ERF109直系同源基因。对十个六倍体小麦TaERF109s的系统发育分类解析出两个主要分支。第I组包含七个TaERF109s（TaERF109A1–A2、TaERF109B1–B2、TaERF109D1–D3），第II组包含三个TaERF109s（TaERF109A3、TaERF109B3、TaERF109D4）。通过表达谱分析鉴定出的所有干旱响应成员都聚集在第I组内，并进一步细分为小的亚组。为了进一步追溯串联复制的TaERF109同源基因的进化历史，研究者利用Triticeae-GeneTribe工具，对包含ERF109同源拷贝的基因组片段进行了微共线性分析。在面包小麦和其他11个小麦族物种的基因组中鉴定到了包含2到6个串联复制的ERF109基因的共线性区块。相比之下，在二穗短柄草、粳稻、高粱或玉米中未检测到此类共线性区块。这些拷贝数变异和染色体分布表明，由串联复制事件形成的ERF109基因簇是小麦族谱系特有的。
过表达TaERF109A2对复杂农艺性状具有多效性影响
为了确定TaERF109s的生物学功能，研究者在春小麦品种“Fielder”中，在泛素启动子控制下，生成了过表达干旱响应的TaERF109A2和干旱不响应的TaERF109D4的转基因小麦株系。分子鉴定确定了9个独立的TaERF109A2过表达株系和2个TaERF109D4过表达株系，由于这些基因的基础表达水平低，与阴性对照植物相比，其诱导倍数超过1000倍。这两个基因的组成型表达对植物结构和生殖发育均产生了显著的多效性影响。在苗期，三个纯合T3代TaERF109A2过表达株系表现出茎和根生长受阻，并伴随分蘖芽加速生长。在抽穗期，与对照相比，TaERF109A2过表达株系表现出超过20天的抽穗延迟、分蘖数显著增加以及叶片变短变薄。成熟植株表现出匍匐生长的习性，株高降低，穗子变小，分蘖数增加超过4倍。同时，TaERF109A2过表达株系存在严重的生殖缺陷，包括极低的结实率和受抑制的籽粒灌浆，产生皱缩的籽粒。而过表达TaERF109D4导致完全不育，没有产生有活力的种子。
TaERF109s正向调控小麦的干旱耐受性和旱后恢复
使用浅容器进行干旱试验，以评估独立于根系结构的干旱恢复能力。虽然TaERF109A2过表达株系和对照植株在脱水条件下都表现出严重萎蔫，但过表达株系在复水后恢复迅速，分蘖和叶片再生增强，并且显示出比对照植株更高的存活率。生化分析进一步揭示，在TaERF109A2过表达植株中，干旱处理前后脯氨酸含量均显著增加，而丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子含量在干旱处理后显著降低。为了验证TaERF109基因家族的胁迫调控作用，研究者使用两个靶向TaERF109基因座保守AP2结构域内相距23 bp位点的向导RNA，进行了CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。经过九个TaERF109基因特异性PCR引物的DNA测序，研究者分离出一个纯合的Taerf109s九重突变体，该突变体在所有TaERF109同源基因中均存在1–43 bp的缺失。在正常生长条件下，Taerf109s突变体与野生型植株在营养生长和生殖生长方面没有显著差异。然而，干旱胁迫加剧了Taerf109s突变体的生长抑制并加速了叶片卷曲。复水两周后，野生型植株完全恢复，而Taerf109s突变体则继续萎蔫，鲜重和干重显著降低。生化分析显示，与野生型植株相比，遭受干旱胁迫的Taerf109s突变体积累了更高的丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子水平，但脯氨酸含量较低。在田间干旱条件下，与野生型相比，Taerf109s突变体分蘖数略有减少，同时每穗可育小花数、每穗粒数和千粒重显著下降。
TaMADS56s作为TaERF109A2的下游效应因子调控小麦营养生长和旱后恢复
为了剖析TaERF109A2介导的形态变化和干旱恢复能力的调控机制，研究者对对照和TaERF109A2过表达幼苗的六周龄幼叶进行了RNA测序。鉴定出8,942个差异表达基因，包括4,607个上调基因和4,335个下调基因。在最显著上调的基因中，有TaMADS56-7D，它是拟南芥中抽穗期调控因子SOC1的直系同源基因。另外两个TaMADS56同源基因也上调。同时，一个MADS18同源基因、一个MADS15同源基因和两个小麦开花位点T基因被强烈抑制。RT-qPCR验证证实了RNA-seq结果，与对照相比，TaERF109A2过表达植株中TaMADS56-7D和TaMADS56-7A分别诱导了1,195倍和207倍，TaFT1和TaFT2分别被抑制了592倍和145倍。
鉴于SOC1样基因在协调植物类群的营养发育和开花时间方面具有保守作用，研究者假设TaMADS56s作为TaERF109A2的下游效应因子调控小麦抽穗期和茎秆结构。为了验证这一假设，研究者在“Fielder”中构建了过表达TaMADS56-7D的转基因小麦株系。分子鉴定确定了七个独立的TaMADS56-7D过表达株系，根据其表达水平选择了其中三个进行详细分析。表型分析显示了TaMADS56-7D过表达对发育过程的剂量依赖性效应。在受控长日照和自然长日照条件下，56-OE1延迟抽穗2天和5天，而56-OE2和56-OE4分别延迟8.5/13.7天和7/12天。所有56-OE株系的分蘖数反应更为明显，分别增加了47.9%–81.9%和44.3%–109.4%。虽然过表达植株的株高、每穗粒数和千粒重有所下降，但由于补偿性分蘖，56-OE1实现了16.70%的产量增加，而56-OE2和56-OE4尽管分蘖极度增加，但由于严重减少的粒数和粒重，产量与对照持平。在56-OE株系和对照之间未观察到根系结构的显著差异。
由于TaMADS56基因在酵母中未显示转录激活活性，研究者提出它们作为转录抑制因子，负向调控小麦中TaMADS18、TaMADS15和TaFT的表达。为了确定这一点，在发芽后15天和50天使用RT-qPCR评估了这些基因的转录水平。在苗期，所有检测的基因在TaMADS56过表达植株和对照植株中均呈现低基础表达。在生殖转换期，对照植株中检测基因的表达水平显著增加，并显著高于TaMADS56过表达植株。这证明了TaMADS56在小麦抽穗调控中作用于TaMADS15、TaMADS18和两个TaFT的上游。
在TaMADS56过表达植株中观察到的增强的营养生长促使研究者探究TaMADS56是否对干旱胁迫耐受性有积极影响。研究者评估了TaMADS56过表达植株和对照植株在营养生长期间的干旱耐受性。在停止浇水两周后，TaMADS56过表达株系和对照植株出现了相似的干旱症状，如叶片卷曲和萎蔫。然而，在复水两周后，56-OE2和56-OE4植株从水分胁迫中恢复得更快，与对照相比表现出显著更高的鲜重和干重。这些发现表明，TaERF109s通过TaMADS56介导的途径调节小麦的营养生长和旱后恢复。
TaERF109A2直接激活TaIPT8以促进小麦中的CK生物合成
为了阐明TaERF109s调控根系形态的分子机制，研究者对RNA-seq数据中的差异表达基因进行了京都基因与基因组百科全书通路分析，以分类和表征其生物学功能。与玉米素生物合成相关的差异表达基因在TaERF109A过表达植株中显著上调。其中，TaIPT8-5B和TaIPT8-5D这两个编码CK生物合成限速酶的异戊烯基转移酶基因在RNA-seq数据中上调，这一发现得到了RT-qPCR的验证。相比之下，TaIPT3和TaIPT6在TaERF109A2过表达植株中下调。
为了确定TaERF109A2是否通过结合其启动子直接激活TaIPT8s，研究者分析了TaIPT8-5B和TaIPT8-5D上游2 kb的调控区域，在每个启动子中鉴定了两个GCC-box基序。使用包含这些核心序列的生物素标记探针进行了电泳迁移率变动分析。结果显示，重组的TaERF109A2蛋白引起了标记探针的迁移率变动，并且这种结合可以被过量的未标记片段竞争性降低，证实了特异性的体外相互作用。使用TaIPT8-5A、TaIPT8-5B和TaIPT8-5D的启动子进行了瞬时荧光素酶报告基因检测。与空载体对照相比，与35S: TaERF109A2共表达显著增加了由TaIPT8-5B和TaIPT8-5D启动子驱动的荧光素酶活性。
异戊烯基腺嘌呤型和反式玉米素型CKs是植物中主要活性CK种类，而糖基化途径是植物防止CK过度积累的关键机制。随着TaIPT8表达水平在TaERF109A2过表达植株中增加，iP型和tZ型CKs（包括它们的糖基化形式，反式玉米素9-葡萄糖苷和异戊烯基腺嘌呤9-葡萄糖苷）的水平显著升高。为了确认TaIPT8-5B和TaIPT8-5D是TaERF109的下游靶标，研究者构建了TaIPT8-5A/5B/5D三重突变体植株，并将其与TaERF109A2过表达株系杂交，将Ubi-TaERF109A2转基因引入突变体背景。尽管A2-OE幼苗由于增强的CK生物合成表现出根和茎短的表型，但TaIPT8突变体与A2-OE杂交的后代表现出与TaIPT8突变体相似的恢复的长根形态。这种遗传互补表明，TaERF109介导的根长调控主要通过TaIPT8依赖的CK生物合成发生。
TaERF109A2过表达通过上调NAS表达增强铁毒耐受性和干旱耐受性
为了识别TaERF109A2过表达植株干旱响应背后的分子决定因素和代谢通路，研究者进行了基因本体富集分析，观察到与NA生物合成过程、NAS酶活性、血红素结合和铁离子结合相关的转录本显著上调。其中，20个编码NAS（催化NA生物合成的关键酶）的差异表达基因在TaERF109A2过表达株系中上调。作为一种非常规氨基酸，NA与铁（II）和其他二价过渡金属离子形成复合物。其过度积累与细胞内金属离子浓度升高有关。与此一致，对转基因幼苗中NA和金属离子含量的测定显示，TaERF109A2过表达植株中的NA、铁、锌、铜和锰含量显著高于对照植株。最近一项关于拟南芥的研究表明，AtERF109通过调控铁响应基因（包括NAS4）来调节铁稳态，这暗示了其小麦同源基因具有类似功能。为了研究小麦中增加的NA生物合成是否能缓解铁毒性，研究者将TaERF109A2过表达幼苗和对照幼苗置于含有0、20、500和1,000 μM FeEDTA的水培培养基中。在正常铁条件下，TaERF109A2过表达幼苗比对照表现出更少的不定根以及更短的主根和茎。然而，当暴露于高浓度FeEDTA时，对照幼苗表现出更明显的茎和根生长抑制。值得注意的是，TaERF109A2过表达植株在铁胁迫下保持了与对照相当的根系结构（长度和不定根数量），而其茎长甚至长于对照。
先前的研究表明，NAS介导的NA积累显著增强了水稻的干旱耐受性。为了阐明NAS基因在小麦应对铁毒性和干旱胁迫反应中的功能，研究者构建了过表达TaNAS6B（在TaERF109A2过表达植株中上调程度最高的NAS基因）的小麦株系。使用20、500和1,000 μM FeEDTA的水培试验表明，TaNAS6B过表达株系在高铁条件下的根长与对照相似，但茎显著更长。随后，研究者选择了两个表达水平相对较高的TaNAS6B过表达株系进行干旱胁迫实验。结果证实，TaNAS6B过表达株系在正常条件下与对照植株相当，但对干旱胁迫表现出更强的耐受性，其特征是叶片卷曲和萎蔫显著减少，复水后鲜重和干重更高。这些结果表明，TaERF109A2通过介导NAS催化的NA积累，赋予了对铁毒性和干旱胁迫的增强耐受性。
讨论
串联复制基因通常编码参与非生物和生物胁迫响应的蛋白质，在植物进化和适应环境变化中发挥关键作用。在多样化的植物类群中，ERF109同源基因对植物激素和非生物胁迫响应迅速上调，在干旱、盐和冷耐受通路中发挥作用。研究者在六倍体小麦中鉴定出10个TaERF109同源基因，其中7个被干旱和细胞分裂素处理显著诱导。功能分析表明，TaERF109A2过表达提高了旱后恢复率和干旱耐受性，而Taerf109s突变体在干旱条件下生长受阻且籽粒产量降低。这证实了TaERF109是小麦干旱耐受性和恢复力的正向调控因子。基因家族的串联复制事件在不同物种中普遍存在，并且功能往往保守。只有约10%的哺乳动物串联阵列是物种特异性的，而在非哺乳动物中这一比例超过20%。这种谱系特异性复制通常驱动适应性性状的进化，使物种能够在特定生态环境中茁壮成长。六倍体小麦的基因组由三个亚基因组组成，每个都源自不同的二倍体祖先物种。在这些二倍体祖先中，ERF109基因以2-4个串联重复形式存在，最终导致不同六倍体小麦种质中有9-10个拷贝。对公共可用基因组的系统发育和微共线性分析表明，ERF109串联复制事件仅发生在小麦族中。ERF109串联拷贝在小麦族作物中的进化保留可能通过功能分化或剂量效应，促进了它们对反复非生物胁迫的增强耐受性。
TaMADS56-7D的表达在TaERF109A2过表达植株中上调超过1,195倍。TaMADS56-7D过表达株系再现了TaERF109A2过表达植株的关键表型，包括延迟开花、增加分蘖数和改善干旱恢复。这表明TaMADS56在抽穗期和分蘖调控中作为遗传下游效应因子发挥作用。在TaMADS56上游2.5 kb基因组区域未鉴定到GCC-box顺式作用元件。考虑到TaMADS56基因含有可能包含增强子元件或用于空间调控的替代启动子的大内含子，TaMADS56是否是TaERF109A2的直接转录靶标需要进一步验证。此外，在TaERF109A2过表达的RNA-seq数据中鉴定出14个含有GCC-box的上调转录因子，这表明TaERF109同源基因可能通过启动TaERF109依赖的转录级联反应，间接调节TaMADS56基因表达。
TaMADS56蛋白是拟南芥SOC1的同源蛋白。调控花发育和开花时间的SOC1样基因已在许多植物类群中得到广泛研究。然而，这些基因均未涉及分蘖或分枝数量的控制。一些AP1/FUL样MADS-box基因不仅在开花时间和花器官调控中起关键作用，还在水稻分蘖协调中发挥重要作用。过表达OsMADS14、OsMADS15和OsMADS18的转基因水稻开花早，抑制了腋芽生长，减少了分蘖数，而OsMADS18敲除突变体比野生型产生更多分蘖。在本研究中，TaMADS56过表达株系在苗期表现出加速的分蘖。然而，在对照和TaMADS56过表达株系中，TaMADS18和TaMADS15的表达水平在此阶段均受到显著抑制。TaMADS15和TaMADS18可能仅参与TaMADS56介导的抽穗期调控。同时，TaMADS56调控小麦分蘖的分子机制需要进一步验证。
水培实验表明，TaMADS56过表达植株的根长未受影响，这表明增加的TaMADS56表达无法解释在TaERF109A2过表达株系中观察到的根生长抑制。植物激素是根生长的主要内源调节因子。在拟南芥中，AtERF109在侧根形成过程中介导茉莉酸和生长素之间的串扰。而在水稻中，OsERF109负向影响乙烯生物合成和干旱耐受性。在小麦中，CK响应转录因子TaERF109A2直接结合TaIPT8B和TaIPT8D启动子中的GCC-box基序，从而快速调节CK生物合成。TaIPT8表达在干旱处理0.5-1小时内达到峰值，然后恢复至基础水平，这与TaERF109A2诱导的动力学模式一致。TaERF109A2过表达植株的根伸长被完全抑制，并且在TaIPT8敲除背景下，TaERF109A2过表达植株的短根表型在很大程度上得到恢复。这些发现表明，TaERF109A2在干旱胁迫早期阶段作用于TaIPT8上游来调节CK生物合成，从而解耦了TaMADS56介导的分蘖通路与根系生长的调控作用。
RNA-seq分析鉴定出20个在TaERF109A2过表达植株中上调的NAS基因。作为NA生物合成的关键酶，NAS蛋白催化这种非常规氨基酸的产生，其作为二价金属离子的内源性螯合剂，有助于维持植物细胞内的离子稳态。NA对Fe2+的螯合降低了其氧化反应性，减轻了Fe2+诱导的细胞毒性。与之前在拟南芥、水稻和小麦中的报告一致，NAS表达在干旱条件下上调。在水稻中，OsNAC6介导的NAS上调增加了NA生物合成，促进过量Fe2+的螯合并抑制羟基自由基的产生，从而增强抗旱性。类似地，TaERF109A2过表达植株中NAS表达升高与NA含量增加相关，而这与小麦对高铁浓度和干旱胁迫的耐受性提高相关。这些发现表明，TaERF109A2可能通过快速上调NAS依赖的NA积累来减轻小麦的干旱诱导氧化胁迫，从而在水分有限条件下缓冲金属离子毒性并维持氧化还原平衡。
串联复制的TaERF109基因家族成员作为分子开关，通过整合激素信号和代谢物生物合成来协调小麦的胁迫响应和发育程序，以平衡生长和胁迫恢复力。这些发现深化了我们对多倍体作物中
