《Scientia Horticulturae》：Antifungal mechanism of selenium against
Botrytis cinerea on grapes: Insights from metabolomic and transcriptomic analyses
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为解决葡萄采后灰霉病造成的巨大经济损失及化学杀菌剂带来的环境污染和抗药性问题，研究人员开展了硒（Se）抑制灰霉菌（Botrytis cinerea）的机制研究。通过多组学联合分析，揭示了Se通过破坏线粒体β-氧化、细胞壁生物合成、能量代谢及致病基因表达等多途径协同发挥抑菌作用，为开发安全、可持续的杀菌剂替代品提供了新策略。
葡萄是全球重要的水果作物，但其采后贮藏常受到灰霉病的严重威胁。这种病害由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起，可导致果实腐烂、品质下降，造成巨大的经济损失。目前，农业生产中主要依赖化学合成杀菌剂进行防治，但长期使用不仅带来了环境污染和农药残留问题，还导致了病原菌普遍产生抗药性。因此，寻找安全、有效且可持续的新型防控手段已成为当务之急。在此背景下，硒（Selenium， Se）作为一种必需的微量元素，因其在植物生长、发育和抗逆性中的有益作用而备受关注。近年来的研究表明，硒在亚致死浓度下表现出广谱的抗真菌活性，但其具体的分子作用机制尚不明确。为了深入解析硒对灰霉菌的抑菌机理，并为开发新型、多靶点的杀菌剂替代品提供理论基础，山西农业大学的研究团队开展了一项结合多组学技术的深入研究。
为了系统地解答上述问题，研究人员采用了体外（in vitro）与体内（in vivo）实验相结合的策略。关键技术方法包括：1) 体外抗真菌活性测定：通过在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基中添加不同浓度的硒（以亚硒酸钠形式供给），评估其对灰霉菌菌丝生长和生物量的抑制作用，并确定18 mg/L为有效作用浓度。2) 扫描电子显微镜（SEM）观察：直观展示硒处理对菌丝、孢子和细胞壁超微结构的损伤。3) 细胞渗漏测定：通过检测可溶性蛋白、糖类、核酸的泄漏以及丙二醛（MDA）含量，评估硒对细胞膜完整性和脂质过氧化的影响。4) 多组学分析：核心部分是使用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析，以及基于Illumina NovaSeq平台的转录组学（RNA-seq）测序，以揭示硒引起的代谢物和基因表达层面的全局变化。5) 实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）：验证转录组数据的可靠性。6) 体内抑菌效果验证：使用“红地球”葡萄果实模型，评估硒处理对灰霉菌侵染和病斑扩展的实际控制效果。
3.1. 体外硒对灰霉菌的抗真菌活性
研究首先在体外评估了硒的抑菌效果。结果显示，硒处理能以剂量依赖的方式抑制灰霉菌的菌丝生长。在18 mg/L浓度下，硒显著减少了菌丝生物量（降低约50%）和菌落直径，明确了其体外抑菌的有效性。
3.2. 菌丝形态的SEM观察
通过扫描电镜观察发现，对照组菌丝形态健康、表面光滑，孢子饱满。而经18 mg/L硒处理后，菌丝出现严重变形，包括不规则分枝、扭曲和塌陷，表面粗糙破碎，孢子皱缩坍塌，细胞壁褶皱显著增加，直观证明了硒对真菌细胞结构的物理破坏。
3.3. 硒引发的灰霉菌细胞质渗漏
硒处理显著增加了灰霉菌细胞内物质的泄漏。可溶性蛋白、碳水化合物和核酸的泄漏量随时间推移而增加，同时指示脂质过氧化的丙二醛（MDA）含量也显著升高。这些结果表明硒破坏了细胞膜完整性，导致了不可逆的膜损伤。
3.4. 代谢组学分析
代谢组学分析揭示了硒处理引起的广泛代谢重编程。在正、负离子模式下共鉴定出数百个差异表达代谢物（DEMs）。KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集分析表明，这些代谢物显著富集于嘧啶代谢、嘌呤代谢、ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢、半乳糖代谢、戊糖磷酸途径、丙酸分解代谢以及支链氨基酸生物合成等通路，提示硒干扰了核酸、能量和抗氧化等多种核心代谢过程。
3.5. 转录组学分析
转录组测序共鉴定出797个差异表达基因（DEGs），其中578个下调，219个上调。基因本体（GO）富集分析显示，DEGs显著富集于膜的组成成分、血红素结合等类别。KEGG通路富集分析进一步指出，硒处理显著影响了过氧化物酶体、脂肪酸降解与代谢、氨基酸糖与核苷酸糖代谢、色氨酸代谢以及同源重组等通路。热图显示，与细胞壁前体生物合成、丙酸代谢、ABC转运蛋白等相关的关键基因表达均发生显著改变。
3.6. 关键基因的qPCR验证
研究人员选取了8个与过氧化物酶体功能、不饱和脂肪酸生物合成、毒力及丙酸代谢相关的关键DEGs进行qRT-PCR验证。结果显示，qPCR与RNA-seq的表达趋势高度一致（R2 = 0.9923），有力地证实了转录组数据的可靠性。
3.7. 转录组与代谢组的联合分析
多组学整合分析表明，硒处理通过扰动核酸、氨基酸、脂质代谢以及跨膜转运、抗氧化活性和碳水化合物代谢等多条通路，共同破坏了灰霉菌的代谢稳态。
3.8. 硒对葡萄灰霉菌的体内抗真菌活性
在葡萄果实模型中，18 mg/L硒处理显著降低了灰霉菌的发病率和病斑直径。例如，接种后48小时，对照组的病斑直径为9.67毫米，而硒处理组仅为4.67毫米，抑制效果显著。这证实了硒在真实的采后环境中同样具有有效的病害控制潜力。
综合全文的讨论与结论，本研究系统地阐明了硒（18 mg/L）对灰霉菌的多靶点抑菌机制。首先，硒直接破坏细胞膜和细胞壁的完整性，导致细胞内容物泄漏和严重的形态学损伤。其次，硒干扰能量代谢，它抑制了线粒体脂肪酸β-氧化（反映在L-棕榈酰肉碱水平下降），同时上调了过氧化物酶体β-氧化相关基因，但这种代偿性途径效率低下且可能产生有害的活性氧（ROS），最终导致细胞能量短缺和氧化损伤加剧。此外，硒处理还导致细胞壁生物合成关键基因的下调和前体物质的积累，进一步削弱了细胞的结构完整性。
在致病性方面，硒下调了与黑色素合成相关的基因Bcbrn2和与脂氧合酶相关的基因Bcole1，从而降低了真菌的毒力和侵染能力。同时，硒还抑制了ABC转运蛋白（如ABCB1和PDR5）的表达，这可能削弱了真菌对外源毒物的外排和糖类物质的转运能力。尽管硒处理也触发了部分抗氧化反应（如过氧化氢酶CAT基因上调），但综合的代谢紊乱和结构破坏效应占据了主导。
最重要的是，这些基于组学的分子机制在葡萄果实模型中得到了验证，硒处理显著抑制了灰霉病的发生和发展。研究表明，硒的作用可能兼具直接抑菌和间接诱导宿主（葡萄）防御反应的双重模式。这项研究为理解硒作为一种可持续农业投入品的抗真菌作用提供了全面的分子框架，为其替代传统化学杀菌剂用于采后病害防治奠定了坚实的理论基础。该论文已发表于园艺学知名期刊《Scientia Horticulturae》。未来的研究可聚焦于真菌对硒的解毒途径，以进一步推动其实际应用。
