24-表油菜素内酯通过缓解氧化损伤增强甜樱桃对细菌性溃疡病的抗性

《Scientia Horticulturae》：24-Epibrassinolide enhances sweet cherry resistance to bacterial canker by alleviating oxidative damage

为解决威胁全球甜樱桃产业的细菌性溃疡病缺乏环保高效防控策略的问题，本研究探究了外源24-表油菜素内酯（EBR）对两种栽培品种的抗病效应。结果表明，0.5 μM EBR处理能显著降低病害症状，并通过增强宿主抗氧化酶（如SOD、CAT、POD等）活性和上调相关基因表达来激活防御响应，进而提升抗病性。体外实验证实EBR无直接抑菌作用。该研究支持EBR作为一种生态友好型调节剂，在多年生果树细菌病害的绿色防控中具有应用潜力。

　　

甜樱桃，以其鲜艳的色泽、酸甜可口的滋味和高营养价值，成为全球温带地区极具经济价值的水果。然而，随着樱桃栽培面积的快速扩张，病害问题日益突出，其中由丁香假单胞菌致病变种（Pseudomonas syringae pv. syringae, Pss）引起的细菌性溃疡病尤为猖獗。这种病害可侵染花朵、叶片、嫩枝和果实，在适宜条件下迅速蔓延，导致产量损失常超过50%，严重削弱树势甚至导致幼树死亡，给全球樱桃产业带来巨大经济损失。面对这一“顽疾”，传统的防控手段显得捉襟见肘。常规的农业操作如修剪工具消毒、清除病枝等虽能减轻危害，但无法完全阻止病害传播。以波尔多液、氢氧化铜为主的化学防治虽有一定效果，但长期使用可能导致药害并诱导病原菌产生抗性，且其环境毒性问题也日益受到限制。与此同时，虽然一些生物防治菌剂（如解淀粉芽孢杆菌D747）已被测试，但其田间防效有限。因此，开发能够增强寄主自身抵抗力、环境友好且高效的病害管理新策略，成为当前研究的迫切需求。

植物自身拥有一套精密的激素调控网络来应对病原侵扰。除了众所周知的乙烯（ET）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）等防御激素外，油菜素内酯（Brassinosteroids, BRs）这类甾醇类植物激素在调节植物免疫方面的作用正逐渐受到关注。其中，24-表油菜素内酯（24-epibrassinolide, EBR）是活性最强的BR类似物之一。已有研究表明，EBR能够增强黄瓜对疫病、柑橘采后病害以及芒果炭疽病的抗性，其作用机制常与激活植物的抗氧化防御系统有关。然而，现有研究多集中在草本植物或采后果实上，关于EBR在多年生木本果树（尤其是对抗细菌性病原）中增强抗病性的作用和机制，仍然知之甚少。基于甜樱桃的高经济价值和其对细菌性溃疡病的脆弱性，西北农林科技大学园艺学院的研究团队在《Scientia Horticulturae》上发表了一项研究，系统探讨了EBR能否成为增强甜樱桃抗病性的“绿色武器”，并揭示了其背后的作用机理。

为开展此项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究选取了两个重要的商业甜樱桃品种‘Rainier’和‘Sunburst’作为实验材料，样本来源于中国陕西铜川果树试验站。核心实验包括离体叶片接种和活体幼苗接种，以模拟病害发生并评估EBR的防效。通过测定病害严重度、发病率及计算病害指数来量化抗病性表型。为了探究EBR的作用机制，研究团队系统检测了病原侵染后叶片中的活性氧（ROS）水平（包括超氧阴离子O₂^-和过氧化氢H₂O₂）、膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量以及相对电导率（REC），以评估氧化损伤程度。同时，测定了六种关键抗氧化及防御相关酶——超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性。此外，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析了这些酶对应编码基因（如PavSOD， PavCAT等）的表达模式。为了区分EBR是直接抑菌还是激活寄主防御，研究还进行了体外抑菌实验，通过纸片扩散法和液体培养监测了EBR对Pss菌体生长的直接影响。所有实验均设置三个生物学重复，数据经过严格的统计学分析。

EBR处理显著增强甜樱桃对细菌性溃疡病的抗性

研究人员用不同浓度EBR预处理离体叶片后接种Pss，发现所有EBR处理（0.25-1 μM）均能显著降低病害严重度，其中0.5 μM效果最佳。‘Rainier’品种的表现始终优于‘Sunburst’，病斑颜色更浅、直径更小。在0.5 μM EBR处理下，‘Rainier’的发病率和病害指数最低。表型分析表明，EBR处理能有效增强甜樱桃对细菌性溃疡病的抵抗力。

EBR处理减轻甜樱桃叶片的氧化损伤

病原侵染引发了强烈的氧化应激。研究发现，EBR处理能显著降低两个品种叶片中O₂^-和H₂O₂的积累水平。同时，EBR有效抑制了膜脂过氧化产物MDA的积累，并降低了相对电导率（REC），表明其缓解了细胞膜损伤。在次级代谢物方面，EBR处理显著提升了两个品种叶片中的类黄酮含量，但对总酚含量的影响存在品种差异（在‘Rainier’中显著增加，在‘Sunburst’中无显著差异）。这些结果说明EBR能有效减轻Pss侵染诱导的氧化损伤。

EBR处理提高甜樱桃叶片的抗氧化及防御相关酶活性

酶活分析显示，EBR处理提升了多个抗氧化和防御相关酶的活性。在两个品种中，SOD和APX活性在EBR处理下均显著高于对照。CAT、POD、PPO和PAL的活性变化则呈现出品种特异性模式。例如，在‘Rainier’中，PPO活性被EBR显著增强；而在‘Sunburst’中，PAL活性在EBR处理下普遍更高。总体而言，EBR通过协调多种酶的活性，帮助维持了病原侵染后叶片内的氧化还原稳态。

EBR处理改变甜樱桃叶片中抗氧化及防御相关基因的表达

基因表达分析进一步揭示了EBR作用的分子基础。在‘Rainier’中，EBR处理显著上调了PavSOD1、PavSOD2、PavAPX2、PavCAT1、PavCAT2、PavPOD1、PavPOD2、PavPPO1和PavPAL2等多个基因的表达。而在‘Sunburst’中，仅有PavSOD1、PavAPX2、PavCAT1和PavPAL2等部分基因被显著诱导。这些基因表达的变化与其对应酶活性的增强趋势基本一致，表明EBR在转录水平上调控了甜樱桃的防御反应，且存在品种依赖性。

EBR处理对Pss体外生长的影响

关键的对照实验表明，EBR在测试浓度下（0.25, 0.5, 1.0 μM）并未在LB平板上形成抑菌圈，也未显著影响Pss在液体培养基中的生长密度和菌落数量。这确凿地证明，EBR对细菌性溃疡病的控制作用并非源于直接杀死或抑制病原菌，而是通过激活植物自身的防御系统来实现的。

综上所述，本研究得出的核心结论是：外源施用低浓度（0.5 μM）的24-表油菜素内酯（EBR）能够有效增强甜樱桃对细菌性溃疡病的抗性。其作用机制主要在于激活寄主自身的防御能力，而非直接抑菌。具体而言，EBR通过上调一系列抗氧化及防御相关基因（如PavSOD， PavCAT， PavPOD， PavAPX， PavPAL等）的表达，进而提高对应酶（SOD， CAT， POD， APX， PAL等）的活性，协同清除过量的活性氧（ROS），减轻氧化损伤和膜脂过氧化，最终达到抑制病害发展的效果。

在讨论部分，作者将本研究发现与已有研究进行了关联。前人工作多关注EBR对真菌病害的防控，而本研究则将其作用拓展至木本果树的细菌病害，丰富了油菜素内酯在植物免疫中的角色认知。研究强调了抗氧化系统在EBR介导的抗病性中的核心地位，并注意到品种间抗性差异可能与苯丙烷代谢途径（由PPO和PAL催化）的激活程度有关，例如‘Rainier’表现出更强的抗性可能与其更高的PPO、PAL活性及酚类、类黄酮积累相关。最重要的是，体外实验明确了EBR的抗病效果来源于“赋能宿主”而非“攻击病原”，这暗示其诱导的抗性可能具有广谱性，为开发不依赖直接杀灭作用的可持续病害管理策略提供了新思路。

这项研究具有重要的理论和实践意义。在理论上，它深化了人们对油菜素内酯，特别是EBR，在多年生木本果树对抗细菌病原过程中的免疫调控机制的理解，填补了该领域的研究空白。在实践上，研究结果支持EBR作为一种环境友好、低毒且能增强植物自身免疫力的生物调节剂，具有应用于甜樱桃乃至其他果树细菌性溃疡病绿色综合治理的巨大潜力。它为减少传统化学农药的依赖、推动果树产业的可持续发展提供了一条有前景的新途径。当然，作者也指出，EBR诱导抗性的稳定性和田间实际防效仍需进一步评估，这将是未来将其推向实际应用的关键步骤。