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本研究通过可见光反射（Vis）、ATR-FTIR和微拉曼光谱结合PLS和ANN模型，评估了热带户外环境中开放和封闭环境下血迹沉积时间（TSD）的预测能力，发现PLS模型表现更优，微拉曼-PLS组合预测误差最低，封闭环境稳定性更好。
Nor Ummiza Kamaruzaman | Muhammad Faisal Khyasudeen | Arniza Khairani Mohd Jamil | Kah Hin Low
马来西亚马来亚大学理学院化学系，50603 吉隆坡，马来西亚
摘要
在法医重建中，准确估计血迹沉积时间（TSD）仍然是一个关键挑战，尤其是在真实的户外环境中。本研究比较了可见光（Vis）反射率、衰减全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱和微拉曼光谱三种方法，并结合了偏最小二乘（PLS）回归和人工神经网络（ANN），用于估计在自然变化的热带户外微环境中老化长达100天的血迹的沉积时间。从多名捐赠者身上采集的血液被滴在玻璃载玻片上，并在两种条件下进行老化：露天暴露和密封在塑料袋中储存。从每个血迹的外圈获取光谱数据，通过标准正态变量变换进行预处理，并按捐赠者分为训练集和独立测试集。可见光反射率主要通过Soret带和α/β带追踪血红蛋白发色团的变化，而ATR-FTIR通过酰胺I-III和O-H/N-H伸缩特征揭示蛋白质的二级结构和水合情况。微拉曼光谱则强调了卟啉的振动模式和C=C伸缩模式，以及芳香族氨基酸和酰胺带，在晚期老化阶段仍具有信息价值。在所有技术中，PLS模型提供了稳健的定量性能（R2P高达0.98，RMSEP通常约为5–10天，RPD>3），其中微拉曼-PLS具有最高的预测准确性，且封闭环境下的模型稳定性优于露天环境。人工神经网络模型并未显示出相对于PLS的系统优势，且对环境特定变异更为敏感。与之前的户外ATR-FTIR研究相比，这些结果表明，在明确定义的环境范围内进行校准后，基于可见光、ATR-FTIR和拉曼的光谱化学模型可以提供有竞争力的沉积时间估计结果，这突显了独立于捐赠者和考虑环境因素的验证在法医解释中的重要性。
引言
血迹分析在法医调查中起着关键作用，为犯罪现场重建和事件时间排序提供了重要信息。在可测量的参数中，血迹的沉积时间（TSD）尤其有价值，因为它可以限定事件时间线并有助于确定或排除嫌疑人[1]、[2]。传统的TSD估计方法，如视觉检查和生化测定，往往具有主观性、破坏性或容易受到环境干扰[3]。这些局限性凸显了需要客观、非破坏性和分析严谨的替代方法，以适应法医应用。
光谱学的进步使得通过非破坏性方式在分子层面研究与老化相关的生化变化成为可能[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。可见光（Vis）反射率主要追踪血红蛋白（Hb）的电子跃迁，Soret带和α/β带反映发色团结构和氧化状态的变化；衰减全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱对偶极矩的变化敏感，能够捕捉蛋白质二级结构（酰胺I-III）和与水合相关的C-H伸缩特征；拉曼光谱对分子极化率的变化作出响应，可以探测卟啉环、芳香族氨基酸侧链和选定的主链模式的特征振动[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。综合这些技术，可以详细表征血迹老化过程中的发色团氧化、蛋白质变性和脱水过程[27]。
当与化学计量模型结合使用时，这些光谱技术可以转化为预测血迹年龄的框架[17]、[18]、[28]、[29]。偏最小二乘（PLS）回归广泛用于捕捉光谱变化与时间之间的线性相关性，而人工神经网络（ANN）可以处理由重叠的生化过程或环境影响引起的非线性动态[30]、[31]、[32]。尽管在之前的TSD研究中，可见光反射率、ATR-FTIR或拉曼光谱都与化学计量方法结合使用，但大多数报告仅关注单一光谱领域，采用依赖捐赠者的验证方案，且通常局限于室内实验室条件。在共同的实验框架下系统比较多种光谱-化学计量组合（特别是使用独立于捐赠者的验证方法）的研究相对较少。
现有文献的另一个局限性是对真实户外环境的有限描述[33]。在法医场景中，血迹可能暴露在户外空气中，受到太阳辐射、湿度波动和温度变化的影响，或者部分被封闭在容器中，此时气体交换和水分流失受到限制[34]。这些不同的微环境会影响氧化、变性和脱水动力学，从而改变可见光和振动光谱特征[35]、[36]、[37]。现有的户外TSD研究主要在选定的基底和气候条件下使用ATR-FTIR，通常没有明确区分不同的微环境或考虑热带环境，而在热带环境中，高湿度和强烈的太阳辐射可能导致不同的降解模式。此外，最近的研究强调了化学计量辅助光谱在区分血液和环境干扰物质方面的实用性，突显了在法医背景下使用稳健的多变量方法的重要性[10]、[38]。
为了解决这些不足，本研究在真实的热带户外微环境中评估了用于估计人类血迹沉积时间的光谱-化学计量方法。在自然变化的热带条件下，从在玻璃基底上老化长达100天的血迹中获取了可见光反射率、ATR-FTIR和微拉曼光谱数据，这些血迹分别在露天和封闭（密封塑料袋）环境中暴露。使用独立于捐赠者的训练集和测试集，开发了PLS和ANN模型，以（i）比较三种技术的预测性能，以及（ii）评估微环境稳定性如何影响光谱老化和模型性能。
样本收集与制备
样本收集与制备
通过使用无菌的一次性采血针从24名健康成年志愿者（15名男性，9名女性；年龄范围：22–45岁）的手指尖采集血液样本。该程序获得了马来亚大学研究伦理委员会的批准（参考编号：UM.TNC2/UMREC_1809），并获得了所有参与者的书面知情同意。
大约20微升的新鲜血液被滴在单独的玻璃显微镜载玻片上。
结果与讨论
血迹在自然变化的热带条件下老化了100天，环境温度范围为23.8至33.5°C，相对湿度（RH）在59%至85%之间。这些条件代表了典型的热带雨林气候，其中温度和湿度共同驱动血液成分的氧化和水解降解[8]。研究了两种微环境：在露天环境中，血迹直接暴露在阳光、风和空气中；在封闭环境中，血迹
结论
本研究比较了可见光反射率、ATR-FTIR和微拉曼光谱与PLS和ANN在估计自然变化的热带户外条件下人类血迹沉积时间（TSD）方面的性能，使用了独立于捐赠者的验证方法，并对比了露天与封闭微环境的影响。总体而言，PLS提供了更一致的预测性能，微拉曼-PLS的预测误差最低，且封闭环境下的模型稳定性优于露天环境；人工神经网络
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
