利用基于萘酰亚胺的荧光探针快速检测生物系统中的组氨酸

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Rapid visual detection of histidine in biological systems by a naphthalimide-based fluorescent probe

高效荧光探针DPA-BID-Cu2?通过金属配位竞争机制实现组氨酸的快速（<20秒）、选择性检测，具有110 nm大斯托克斯位移和低背景干扰，适用于尿液、活细胞及植物组织等多场景生物分析，并配套开发便携式双管检测装置。

　　

陈旭|曾芳|吴水珠

中国华南理工大学材料科学与工程学院，发光材料与器件国家重点实验室，广东省分子聚集体发光重点实验室，广州510640

摘要

组氨酸（His）是一种必需氨基酸，参与多种生理和代谢途径，是代谢紊乱、营养状况和疾病进展的重要生物标志物。本文报道了一种基于萘酰亚胺-二吡啶胺的荧光探针（DPA-BID-Cu²⁺），能够快速、选择性地检测组氨酸。该探针与Cu²⁺形成非发射复合物，其中萘酰亚胺核心的荧光被有效抑制。当加入组氨酸时，通过竞争性配位取代Cu²⁺，从而通过置换诱导的“开启”机制恢复强烈的荧光。该系统可在20秒内实现实时检测，并表现出110纳米的较大斯托克斯位移，提供出色的信号清晰度和最小的背景干扰。该探针在包括尿液、活细胞、洋葱表皮和拟南芥在内的多种生物基质中表现出优异的选择性和灵敏度，无需样品预处理即可直接可视化。此外，基于该系统开发了一种便携式双管检测装置，通过即时混合和紫外光照射下的荧光读数实现简单的现场组氨酸检测。总体而言，这项工作介绍了一种高效、快速响应且可现场应用的荧光平台，为临床和农业环境中的即时诊断、营养监测和原位生物分析提供了重要前景。

引言

在生物流体中检测和定量氨基酸对于诊断、监测和理解各种生理和病理状况至关重要[1]、[2]。氨基酸是蛋白质的基本构建块，也是代谢途径、信号分子和基因表达调节剂的关键中间体[3]、[4]、[5]。其中，组氨酸是一种生物必需的α-氨基酸，因其多方面的生理和生化作用而受到特别关注。组氨酸参与多种代谢途径，作为多种生物活性化合物的生物合成前体，如组胺（免疫反应和神经传递的关键介质）、肌肽（肌肉中的抗氧化剂和pH缓冲剂）和尿黑酸（皮肤中的光保护剂）[6]、[7]。此外，其咪唑侧链赋予其独特的反应性，使其能够参与酶催化、质子转移以及与Zn²⁺和Cu²⁺等生物相关阳离子的配位[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。

鉴于其广泛的生物学作用，组氨酸水平异常与多种临床状况密切相关，包括组氨酸血症、肾小管功能障碍、肝脏疾病和营养缺乏[13]、[14]、[15]。由于组氨酸还调节免疫功能、神经信号传导、氧化应激和金属稳态，它作为早期疾病诊断和治疗评估的有希望的生物标志物。因此，开发可靠、易于获取且快速的组氨酸检测方法——尤其是在尿液等容易获得的基质中——对于临床和健康筛查应用具有重要意义。

传统方法（包括质谱和高性能液相色谱）具有高准确性和灵敏度，但存在主要限制，如繁琐的样品预处理、高昂的仪器成本以及需要专业操作人员[16]、[17]、[18]。这些缺点限制了它们在即时检测（POCT）或现场分析中的应用，而此时迫切需要快速、经济且便携的检测工具。

荧光探针因其操作简便、非侵入性、高灵敏度和实时响应而成为非常有前景的工具[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。特别是具有较大斯托克斯位移的荧光团显著减少了光谱重叠和自淬灭，从而提高了信号清晰度和检测可靠性[24]、[25]、[26]。此外，能够产生快速且视觉上可区分响应的探针使得检测直观及时，非常适合现场应用。

组氨酸的咪唑结构对过渡金属离子（尤其是Cu²⁺和Zn²⁺）具有很强的亲和力，形成稳定的配位复合物[11]、[12]、[27]、[28]。这一化学性质为设计金属介导的荧光探针提供了宝贵的基础。然而，尽管有这些潜力，现有的探针在尿液、活细胞和植物组织等复杂生物环境中对组氨酸的选择性和灵敏度仍不高。在这些基质中，来自多种生物分子的干扰会严重影响检测精度和稳定性，凸显了需要更稳健的传感器系统。

为了克服这些挑战，我们设计并合成了一种基于萘酰亚胺-二吡啶胺的荧光探针（DPA-BID-Cu²⁺），用于选择性和灵敏地检测组氨酸（图1）。该探针结构将萘酰亚胺荧光团与二吡啶胺（DPA）配体结合，与Cu²⁺形成非发射复合物，由于荧光被有效抑制。当加入组氨酸时，Cu²⁺与组氨酸之间的更强亲和力触发配体置换反应，释放荧光团并恢复明亮的绿色荧光。这种置换驱动的开启机制实现了快速（<20秒）且可见的组氨酸检测，伴随着110纳米的显著斯托克斯位移，确保了高信号清晰度。除了出色的灵敏度和选择性外，DPA-BID-Cu²⁺在多种生物平台上表现出广泛的应用性，包括尿液样本、活细胞、洋葱表皮和拟南芥，显示出其在临床、生物医学和农业应用中的巨大潜力。此外，我们还开发了一种便携式双管检测装置，用于实际现场使用。该装置将分析物和探针溶液分开存储在两个隔室中，确保长期储存，并在混合后立即产生荧光响应。这种设计消除了底物固定的需要，保证了性能的一致性和操作的简便性。

总的来说，DPA-BID-Cu²⁺系统结合了简便性、速度、选择性和视觉读数能力，为下一代组氨酸传感器的发展铺平了道路，适用于即时诊断、代谢监测和植物健康评估。其设计不仅推进了组氨酸传感化学的发展，还为开发可现场应用的荧光生物分析设备提供了通用策略。

光谱测量的一般程序

将探针DPA-BID-Cu²⁺溶解在EtOH溶液中，制备1 mM储备液。然后将此储备液加入HEPES缓冲液（20 mM，pH=7.4）中，制备测试溶液（根据需要添加或不添加各种物质进行相应测量）。

样品制备

4T1细胞在37°C、5% CO₂的潮湿培养箱中培养，使用添加了1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基。

组氨酸的探针设计和检测机制

DPA-BID的合成涉及一个简单的两步亲核取代反应（图S1）。第一步形成含有醚链的酰亚胺中间体，这提高了化合物的水溶性[29]。萘酰亚胺核心是一个强疏水的平面共轭系统，这通常会导致在常见有机溶剂中的聚集，从而妨碍后续的衍生化和光谱表征。引入二乙基

结论

总之，我们成功开发了一种基于萘酰亚胺-DPA的荧光探针DPA-BID-Cu²⁺，用于高度选择性和灵敏地检测组氨酸（His）。该探针通过开启机制工作，其中Cu²⁺与荧光团DPA-BID结合时荧光被抑制，随后通过组氨酸与Cu²⁺的竞争性结合快速恢复荧光。该探针具有110纳米的较大斯托克斯位移和小于20秒的快速响应时间，最大限度地减少了激发光的干扰

CRediT作者贡献声明

陈旭：概念构思、研究、方法论、数据分析、初稿撰写、数据管理。曾芳：概念构思、项目管理、数据分析、资金获取、监督、资源协调、撰写及审稿编辑。吴水珠：概念构思、数据分析、项目管理、资金获取、监督、资源协调、撰写及审稿编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号52373209和22274057）和广东省分子聚集体发光重点实验室基金（编号2023B1212060003）的支持。