免疫磁性和免疫金夹心检测方法结合飞行扫描激光解吸-电感耦合等离子体质谱（fsLA-ICP-MS）用于从血液样本中检测伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi），作为莱姆病诊断的概念验证
《Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy》：Immunomagnetic and immunogold sandwich assay for
Borrelia burgdorferi detection from blood samples by fsLA-ICP-MS as a proof-of-concept diagnosis of the Lyme Disease
编辑推荐：
莱姆病诊断新方法：基于磁分离和金纳米颗粒标记的飞秒激光解吸-电感耦合等离子体质谱检测，在人工血液中实现高灵敏度定性检测，验证了纳米材料标记与fsLA-ICP-MS联用的可行性。
安东尼亚·托斯卡（Antonia Toska）|南-塔伊·尹（Nang-Htay Yin）|多米尼克·福瓦（Dominique Foix）|范妮·克拉维里（Fanny Claverie）|梅拉尼·拉姆齐尔（Mélanie Ramseyer）|卢布娜·穆西姆（Loubna Mouhssim）|劳伦斯·林根巴赫（Laurence Ringenbach）|于格·加斯坎（Hugues Gascan）|乔阿希姆·阿卢什（Joachim Allouche）|克里斯托夫·佩谢兰（Christophe Pécheyran）
分析科学与环境材料物理化学研究所（IPREM UMR 5254 CNRS），波城大学及阿杜尔地区大学（UPPA），Helioparc科技园区，2 Avenue du Président Pierre Angot，波城64053，法国
摘要
本文描述了一项概念验证研究，该研究利用fsLA-ICP-MS技术，在免疫磁分离和免疫金染色之后，对人工血液样本中的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）进行了定性检测，显示出在莱姆病（LD）诊断中的巨大潜力。研究建立了一种高效的磁分离方法，用于从10毫升样本中预浓缩B. burgdorferi并去除血液基质，该方法使用了直径为300纳米的磁性纳米颗粒（MNPs），这些纳米颗粒与抗B. burgdorferi抗体结合。在用直径3纳米的金纳米簇（AuNCs）与另一种抗B. burgdorferi抗体结合后，对B. burgdorferi进行了197Au fsLA-ICP-MS定性检测。整个夹心免疫测定是在添加了2·106个细菌菌落的10倍稀释人工血液样本中进行的，并且针对E. coli进行了特异性测试。成功检测到了400个B. burgdorferi菌落，其197Au CPS强度比无细菌和无E. coli的阴性对照样本高出25至20倍，显示出在实际应用中的巨大潜力。
引言
莱姆病（LD），或称伯氏疏螺旋体病，是欧洲最主要的媒介传播疾病，每年新增病例约为65万至85万例。[1]，[2]，[3] 在美国，每年估计有47.6万例。[4] 早期诊断对于防止疾病进展到更严重的阶段（如神经损伤或关节炎）至关重要。[5] 然而，由于病原体Borrelia burgdorferi的特性，莱姆病的诊断仍然极具挑战性。这种细菌在临床样本中的含量非常低，例如每毫升血液中只有0.1个细菌细胞，[6] 并且其基因组、在人体内的传播方式以及地理分布存在很大差异。目前最常用的莱姆病诊断方法是间接的两层血清学检测，该方法旨在检测感染后患者免疫系统的激活情况。[7] 但由于早期产生的抗体量通常较低，或者在不同个体的免疫系统反应下，这种方法的分析性能受到限制。在直接检测方法中，通过聚合酶链反应（PCR）扩增细菌DNA在滑液样本中显示出40–96%的显著敏感性。[8] 然而，在血液样本中，观察到的敏感性较低，仅为10–20%，这可能是由于细菌在血液中的存在量低或短暂。此外，血液中可能存在的PCR抑制剂会进一步降低PCR的敏感性。[3]，[8]，[9] 最近在B. burgdorferi直接检测领域取得了一些新进展。Molins等人利用液相色谱-质谱技术鉴定出一种代谢组生物标志物，能够在血清样本中以95%的特异性和88%的敏感性检测到B. burgdorferi。[10] Goff等人使用拉曼光谱技术在血液样本中检测到B. garinii和B. afzelii，特异性和敏感性分别为90%和85%。[11] Snyder等人开发了一种T2磁共振技术，能够在全血样本中检测到B. burgdorferi、B. afzelii和B. garinii，检测限（LOD）分别为每毫升8个、8个和5个细菌细胞。[12] 尽管有这些有希望的进展，但要实现莱姆病的明确和可靠的诊断，仍需要超高灵敏度，能够在低至每毫升0.1个细菌细胞的浓度下检测到Borrelia，同时还需要具备多重检测能力。
在这方面，基于元素标记的感应耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析是一种新兴方法，能够检测到包括蛋白质、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18] 抗原、[18]、[19]、[20] 病毒颗粒、[21] 病毒、[22] 细胞[23]、[24]、[25]、[26] 和细菌[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35] 在内的生物分子，其检测限极低。尽管ICP-MS仪器在痕量金属分析方面表现出色，但生物分子通常难以被检测到。生物分子中存在的元素（如C、N、O和S）具有较低的电离效率[36] 和较高的自然丰度，这些元素在化学试剂、实验室气氛和等离子体气体中普遍存在，导致即使在没有生物分析物的情况下也会增加ICP-MS的背景信号。此外，这些元素缺乏对特定生物分子的识别能力。元素标记的ICP-MS方法通过简单地应用元素标记（如镧系元素[16]、[17]、[18] 或金属纳米颗粒，特别是金（AuNPs）[31]、[32]、[33] 来克服这些限制。通常通过应用生物受体分子（如抗体）来实现对目标生物分子的特异性标记，这些抗体与其相应抗原的结合常数在107到1012 M?1之间。[37]
对完整细菌的ICP-MS分析特别有趣，因为它可以提供准确的细菌数量定量，这是传统方法（如培养皿和光密度测量）无法获得的。从实际临床样本中准确且超灵敏地计数细菌对于确定感染的存在和阶段至关重要。针对完整细菌的单细胞（sc）-ICP-MS方法很有价值，但由于样本引入等离子体过程中的损失而受到限制。最近，样本引入系统的设计有了显著改进，使得引入ICP的效率提高了100%[38]、[39]、[40]、[41]。然而，这些传输效率是在使用纳米颗粒时评估的，而观察到细菌引入效率有所下降[42]，同时还存在细胞大小依赖性[43]、[44]。另一方面，激光消融（LA）固体样本引入系统可以在消融整个样本表面后进行整体样本分析。这样，至少可以获得每个样本区域的分析信息，从而实现完整的细菌计数。LA-ICP-MS成像是一种强大的技术，具有高空间分辨率和灵敏度，使其优于其他方法（如辉光放电（GD）-MS。[45] 到目前为止，LA-ICP-MS成像已广泛应用于各种应用中，包括与元素标记结合的蛋白质检测（例如在印迹膜[46]或微阵列[47]中的检测），以及肌肉[48]、组织[49]、器官[50] 和细胞的成像[51]。然而，其在细菌中的应用目前仅限于细菌蛋白质组分析[52] 和元素组成测定[53]，尚未作为细菌计数和诊断的方法进行测试。
在这项概念验证研究中，首次建立了用于直接通过fsLA-ICP-MS分析从血液样本中定性检测B. burgdorferi的夹心免疫测定方法。所提出的方法基于先前的记录（每毫升血液中存在0.1个细菌细胞[6]），开发了一种高效的磁分离方法，用于从10毫升样本中预浓缩细菌并去除血液基质。为此，使用链霉亲和素包覆的磁性纳米颗粒（strept-MNPs）通过56Fe ICP-MS分析了两种自制磁分离装置的性能。首先，通过用300纳米strept-MNPs与生物素化的抗B. burgdorferi抗体进行免疫磁分离来分离细菌。随后，使用与另一种抗B. burgdorferi抗体结合的3纳米AuNCs进行免疫金标记进行检测。这项概念验证研究证明了在缓冲样本中特异性检测B. burgdorferi的能力，突显了元素标记fsLA-ICP-MS方法在莱姆病确诊中的潜力。
部分内容
化学试剂
单分散超顺磁颗粒Bio-Adembeads Streptavidin plus 0323（300纳米，磁化强度40 emu/g，浓度5 mg/ml，结合能力>1200 pmol/mg）和Bio-Adembeads Streptavidin plus 0321（100纳米，磁化强度40 emu/g，浓度5 mg/ml，结合能力>3000 pmol/mg）购自Ademtech（法国南锡）。单分散超顺磁微粒Invitrogen Streptavidin Dynabeads M-280（2.8微米，结合能力650–900 pmol/mg），磷酸盐缓冲盐水（PBS，Invitrogen），牛白蛋白/第五组分
磁分离优化
考虑到血液中B. burgdorferi的浓度非常低，每毫升血液中仅含有1个细菌[6]，因此从10毫升样本中定量预浓缩这些细菌对于直接检测和确诊莱姆病至关重要。在本研究中，通过使用strept-MNPs和磁分离装置实现了细菌的分离和预浓缩。图2中展示的商业供应的strept-MNPs的TEM图像证实了预期的形态
结论
本研究开发了一种新的分析方法，能够通过197Au fsLA-ICP-MS从10倍稀释的人工血液样本中定性检测B. burgdorferi。建立了一种新的夹心免疫测定方法，使用两种类型的抗B. burgdorferi抗体4C3和8G2，分别与300纳米strept-MNPs和3纳米AuNCs结合，形成MNPs-4C3和AuNCs-8G2免疫探针。该测定方法用于从10毫升人工血液样本中分离出2·106个B. burgdorferi菌落
CRediT作者贡献声明
安东尼亚·托斯卡（Antonia Toska）：撰写——原始草稿，研究，概念构思。南-塔伊·尹（Nang-Htay Yin）：研究。多米尼克·福瓦（Dominique Foix）：研究。范妮·克拉维里（Fanny Claverie）：研究。梅拉尼·拉姆齐尔（Mélanie Ramseyer）：研究。卢布娜·穆西姆（Loubna Mouhssim）：研究。劳伦斯·林根巴赫（Laurence Ringenbach）：资源获取，项目管理，方法学。于格·加斯坎（Hugues Gascan）：验证，方法学。乔阿希姆·阿卢什（Joachim Allouche）：验证，监督，方法学，概念构思。克里斯托夫·佩谢兰（Christophe Pécheyran）：撰写——审稿与编辑，验证，监督，
致谢
本研究得到了波城大学及阿杜尔地区大学（UPPA）的“E2S能源环境解决方案”项目和法国国家研究署（ANR）的财政支持。作者特别感谢Alain Trautmann和Raouf Ghozzi在整个研究过程中提供的宝贵见解。
