《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Communication of bifunctional G-quadruplex chaperone with aptamer for highly selective adenosine signaling by an ESIPT fluorogen
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腺苷检测新方法：基于aptamer-G4组装体的ESIPT荧光探针实现高特异性血清检测。该体系利用G4的负电荷抑制腺嘌呤干扰，通过DNA结构通讯触发3-羟基黄酮的ESIPT荧光增强，解决传统荧光探针灵敏度低和选择性差的问题。
陈启瑶|黄思慧|周嘉慧|陈嘉慧|王丹丹|张晴晴|周晓顺|邵勇
教育部先进催化材料重点实验室，浙江师范大学化学与材料科学学院，浙江省金华市321004，中国
摘要
腺苷（Ade）是能量代谢、信号传导、免疫调节和心血管保护等方面的重要生物活性分子。在缺血发作期间，血清中的腺苷浓度可异常升高至几微摩尔（μM）水平，而正常情况下其浓度为纳摩尔（nM）级别。目前开发的针对腺苷和腺苷酸的适配体方法被广泛用作直接的生物传感模型。然而，至今尚未找到一种理想的无标记方法，该方法应具备高选择性（腺苷相对于腺苷酸）、在低浓度（几微摩尔）下仍能产生荧光信号，并能校正样品基质带来的干扰。本研究发现，双链DNA分子能与G-四链（G4）伴侣蛋白相互作用，通过激发态分子内质子转移（ESIPT）过程使3-羟基黄酮类化合物发出绿色荧光；同时，较短波长的蓝色参考信号不受影响。通过对双链DNA进行改造并引入新的适配体，成功实现了对腺苷的特异性响应，而G4伴侣蛋白中的高电荷密度则抑制了腺苷酸与适配体的结合。因此，G4伴侣蛋白具有双重功能。这种适配体-G4复合体能够在不受血清基质干扰的情况下有效用于血清分析。此外，腺苷脱氨酶（ADA）的实验也验证了该复合体对腺苷的特异性，从而可以监测腺苷的动态变化及ADA的活性。预计该方法可通过选择合适的G4伴侣蛋白扩展到其他适配体的检测中。
引言
腺苷（Ade）是一种内源性嘌呤核苷，广泛存在于人体内，参与多种生理和病理过程，在能量代谢、信号传导、免疫调节和心血管保护等方面发挥关键作用。在病理状态下，腺苷浓度可升高至微摩尔级别。然而，高浓度的腺苷可能促进肿瘤血管新生并增强肿瘤细胞的迁移和生长。因此，腺苷成为诊断缺血性心血管疾病的潜在生物标志物。缺血发作时，血清中的腺苷浓度可从正常水平（纳摩尔）升高至1–50微摩尔。除了传统的可识别探针外，适配体也被广泛用于通过荧光[12]、电化学[19]、比色法[20]和衍射[21]等方法选择性检测腺苷和腺苷酸（通常是ATP）。在荧光方法中，荧光共振能量转移（FRET）是最常用的适配体传感器设计策略[22]：适配体和短互补DNA链分别被荧光供体和受体修饰，目标分子与适配体结合后会使供体荧光减弱，从而产生荧光变化[12, 24, 25]。尽管现有适配体对腺苷和腺苷酸均有响应，但提高腺苷选择性的研究较少。刘等人[26]首次尝试通过改造适配体结合位点附近的碱基来提高其对腺苷的特异性；肖等人[10]则通过突变适配体结合位点的核苷酸来提升特异性。这些方法使用的荧光探针（如SYBR）在腺苷结合时会产生强烈的荧光减弱效应。然而，开发一种满足以下要求的理想荧光检测方法仍面临挑战：（1）高选择性（腺苷相对于腺苷酸）；（2）在腺苷存在下产生荧光信号；（3）对微摩尔浓度范围内的腺苷具有高灵敏度；（4）能够校正环境干扰的参考信号。
本研究采用带有G-四链（G4）伴侣蛋白的适配体作为检测工具。G4是一种由四个G碱基对组成的四链结构，通过阳离子（尤其是K+）稳定。由于其单位长度上的电荷密度高于双链DNA，G4伴侣蛋白应能抑制腺苷酸与适配体的结合，从而提高腺苷的选择性。腺苷结合后，适配体会发生重折叠并与G4结构相互作用，引发荧光信号。天然3-羟基黄酮衍生物被用作荧光团，因为这类化合物在光激发下可通过C环内的3-OH和4-C=O之间的激发态分子内质子转移（ESIPT）产生荧光，其荧光光谱与正常状态相比具有更大的斯托克斯位移[28, 29]，因此可作为环境干扰的校正参考。
材料与试剂
4′-羟基黄酮醇（4′-HF）、3′,4′-二羟基黄酮醇（3′,4′-dHF）、4′,7-二羟基黄酮醇（4′,7-dHF）、4′-甲氧基黄酮醇（4′-OMeHF）、3′,4′,5′,7-四羟基黄酮醇（3′,4′,5′,7-fHF）、3′,4′,7-三羟基黄酮（3′,4′,7-tHF）和硫黄素T（ThT）分别购自MCE有限公司（上海）和AAT Bioquest公司（美国桑尼维尔）。DNA浓度（表S1，TaKaRa Biotechnology有限公司，大连）通过紫外吸收法在260 nm波长处测定。
双链DNA与G4伴侣蛋白相互作用，实现荧光信号增强
由于适配体在腺苷存在下通常会形成发夹结构，我们首先研究了4′-羟基黄酮醇（4′-HF，图1A）与带有G4伴侣蛋白的双链DNA模型（D-G4，图2）的结合情况。研究表明，D和G4之间的界面是某些荧光配体的优选结合位点[30–34]。我们发现，当发夹结构与人类端粒DNA的连接链（5′-TTA-3′）正确配对时，可以增强腺苷的检测效果。
结论
综上所述，双链DNA与G4伴侣蛋白的有效相互作用为天然荧光团提供了理想的结合环境，促进了ESIPT过程，同时不影响正常参考信号。4′-羟基黄酮醇被证实为最佳的荧光配体。随后，我们将腺苷适配体与G4伴侣蛋白结合，形成了对腺苷高度敏感的检测体系。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了浙江省自然科学基金（项目编号LD25C050003和LQ22B050003）以及国家自然科学基金（项目编号22274142、21675142和22304162）的支持。
