银纳米颗粒和植物生长调节剂通过类原球茎结构促进了Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.的微繁殖

《South African Journal of Botany》：Silver nanoparticles and plant growth regulators improved micropropagation of Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. via protocorm-like bodies

Anoectochilus roxburghii高效微繁殖技术通过AgNPs处理 floral-bud、原球茎再生及PLB增殖实现，最适培养基含BAP、NAA及AgNPs，90天PLB增殖达50.33个/外植体， shoot再生35个/PLB簇，炼苗后12个月存活率85%，金丝桃苷含量达2.591%。

　　

Vu Quoc Luan|Phan Le Ha Nguyen|Nguyen Thi Nhu Mai|Do Manh Cuong|Duong Tan Nhut|Tran Thi Tam|Tran Cong Luan|Hoang Thanh Tung

越南达拉特生命科学研究所（VAST），670000

摘要

本研究开发了一种高效的微繁殖技术，用于Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.的繁殖。该技术包括原球茎的再生、类原球茎结构（PLBs）的诱导与增殖、芽的再生、体外生根以及适应环境的培养过程。实验中使用了银纳米颗粒（AgNPs）对花蕾进行表面消毒以促进原球茎的生成。原球茎被进一步分化为节部、居间分生组织和节间部分，在植物生长调节剂（PGRs，如生长素和细胞分裂素）以及银纳米颗粒的作用下形成PLBs。此外，还评估了有机添加剂（椰子水、马铃薯淀粉和蛋白胨）对PLBs增殖和芽再生的影响，以及AgNPs对体外生根、适应环境及金丝桃苷积累的作用。30天后，花蕾外植体中有83.00%产生了原球茎；而在添加了1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（BAP）或噻二唑酮（TDZ）的Schenk & Hildebrandt（SH）培养基上，仅60天后才观察到原球茎的形成。在含有BAP、α-萘乙酸（NAA）和1.5 mg/L AgNPs的SH培养基中，PLBs主要在节部与居间分生组织交界处形成。90天后，在添加了20%椰子水、1.0 mg/L BAP、0.5 mg/L NAA和1.5 mg/L AgNPs的SH培养基上，PLBs的增殖率（50.33 PLBs/外植体）和芽的再生数量（35个芽/PLB簇）达到最高。含有2.0 mg/L AgNPs的SH培养基有利于幼苗的生长（包括幼苗高度、叶片数量和宽度、根的数量和长度、鲜重/干重以及SPAD指数——叶绿素含量）。含有2.0 mg/L AgNPs的培养基培养出的幼苗在泥炭藓：珍珠岩（1:1）基质中经过12个月的温室适应后，存活率达到85%。随着培养时间的延长（3个月、6个月、9个月、12个月），金丝桃苷的含量逐渐增加，12个月时整个植株中的含量达到峰值2.591%。本研究建立了一种通过原球茎和PLBs再生来高效繁殖A. roxburghii的方法。

引言

Anoectochilus属植物为多年生草本植物，在中国及其他亚洲国家被长期用于传统医学（Yuan et al., 2022; Qiu et al., 2023）。Anoectochilus roxburghii生长缓慢，野生状态下种子发芽率较低，通常生长在常绿阔叶林的湿润环境中；它被广泛用于治疗糖尿病、肝脏疾病、风湿病、高脂血症和哮喘，并具有增强体质的作用（Wang et al., 2020; Lin et al., 2020; Gao et al., 2021; Zhang et al., 2024）。由于过度采伐，该物种受到威胁，已被列入越南红色名录，需要紧急保护（Gam et al., 2020）。

金丝桃苷（3-O-β-D-葡吡喃糖基-(3R)-羟基丁内酯）是A. roxburghii的主要生物活性成分（Yuan et al., 2022; Zhang et al., 2025）。其含量受植物年龄、栽培条件、产地和基因型的影响（Wang et al., 2022; Luan et al., 2025; Zhang et al., 2025）。

随着野生资源的减少，对A. roxburghii的人工栽培需求不断增加，中国草药市场每年交易量接近一千吨（Chen et al., 2021; Zhang et al., 2024）。为了满足大规模栽培的需求，研究人员开发了利用茎段、芽尖和节段进行体外繁殖的方法（Wang et al., 2022; Zhang et al., 2025）。体外植物形态发生受多种因素影响，包括植物生长调节剂、培养基组成、外植体类型和碳水化合物来源（Gautam et al., 2024）。不同属和来源的外植体在通过PLBs或体细胞胚胎发生进行再生方面的能力存在差异（Sherif et al., 2016, 2018; Wang et al., 2022; Zhang et al., 2025; Luan et al., 2025; Han et al., 2025; Wei et al., 2025）。

兰花属于难以繁殖的植物，只有少数属能够直接或间接通过不同来源的外植体进行形态发生（如原球茎结构或体细胞胚胎发生）。PLBs在兰花品种繁殖中起着关键作用（Han et al., 2025; Wei et al., 2025）。已有研究表明，两种兰花A. elatus和A. roxburghii的叶片和节段外植体在体外条件下能够发生形态发生（Sherif et al., 2016, 2018; Wang et al., 2022; Zhang et al., 2025; Luan et al., 2025; Luan et al., 2025）。

银纳米颗粒（AgNPs）已被用作外植体表面消毒剂（Deshmukh et al., 2019; Ahmad et al., 2020）、形态发生调控剂（Cuong et al., 2021; Tung et al., 2021, 2022）以及内源物质的改变剂（Phong et al., 2022; Cuong et al., 2023）。研究表明，AgNPs作为杀菌剂或培养基添加剂可改善多种植物的生长、幼苗质量和生化反应（Nhut and Tung, 2024）。然而，关于AgNPs对Anoectochilus的影响的数据仍然有限。因此，本研究旨在通过评估AgNPs、PGRs和有机添加剂在原球茎再生、PLBs诱导与增殖、芽再生、体外生根、适应环境及金丝桃苷积累各阶段的作用，开发出高效的A. roxburghii微繁殖技术。

实验材料

Anoectochilus roxburghii植株于4月至5月在越南拉姆东省（Lam Dong province）的Bidoup Mount Ba国家公园采集，地理坐标为北纬12°00′00″至12°30′00″，东经108°35′00″至108°75′00″，海拔范围1400至2287米，项目编号为106.01–2019.48（越南NAFOSTED）。供体植株在达拉特生命科学研究所（VAST）的温室中保存。温室条件为相对湿度60-90%，温度16-25°C。

培养条件

体外培养在25 ± 2°C、16小时光照周期下进行，使用白色荧光灯（Rang Dong, Vietnam），光照强度为40-45 μmol/m2/s，相对湿度为55-60%。培养基在121°C、1 atm条件下高压灭菌30分钟。温室培养条件为光照强度< 150 μmol/m2/s，温度15-25°C，相对湿度65-85%。

统计分析

每个处理重复三次，每次包含20个外植体。数据使用SPSS 16.0版本（SPSS Inc., USA）进行分析。平均值通过Duncan多重范围检验在5%的显著性水平上进行区分（Duncan, 1995）。

原球茎再生

未经AgNPs处理的 Flower buds 在培养基中消毒并添加植物生长调节剂后，60天内的存活率（38.33%-58.33%）、原球茎再生率（0%-46.66%）和原球茎数量（0-3.26个原球茎/外植体）较低（表1，图2A-C）。添加AgNPs显著提高了外植体的存活率和再生率。添加了1.0 mg/L BAP或TDZ以及1.0 mg/L AgNPs的SH培养基获得了最高的存活率（80.00%和83.33%）和原球茎再生率（61.66%）。

结论

我们通过原球茎再生、PLBs诱导与增殖、芽再生、体外生根及适应环境培养，建立了一种高效的Anoectochilus roxburghii微繁殖技术。花蕾作为原球茎生成的新外植体来源表现出良好效果。在含有1.0 mg/L BAP、0.5 mg/L NAA、1.5 mg/L AgNPs和20%椰子水的SH培养基上，PLBs的增殖率和芽的再生效果最佳。体外生根及幼苗质量也得到了显著提升。

伦理批准与参与同意

本研究遵循了相关法规和指南进行。

出版同意

不适用。

资金支持

本研究得到了越南国家科学技术发展基金会（NAFOSTED）的支持，项目编号为106.01-2019.48。

致谢

不适用。

伦理批准

本文不涉及任何涉及人类参与者或动物的实验。

数据可用性

由于本研究未生成数据集，因此不适用数据共享。

研究涉及的人类和动物权利

本研究未涉及人类或动物参与者。

CRediT作者贡献声明

Vu Quoc Luan：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，项目管理，资金筹集，概念构思。Phan Le Ha Nguyen：方法学研究，实验设计。Nguyen Thi Nhu Mai：方法学研究，数据管理。Do Manh Cuong：方法学研究，实验设计。Duong Tan Nhut：方法学研究，数据管理。Tran Thi Tam：方法学研究，实验设计。Tran Cong Luan：实验设计。Hoang Thanh Tung：撰写——审稿与编辑，验证，方法学研究。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者衷心感谢越南达拉特大学的Hoang Thi Nhu Phuong副教授对手稿英文版本的编辑工作。