猫精原干细胞中CXCR4、ITGB1和FGFR3的表达模式

《Theriogenology》：Expression Patterns of CXCR4, ITGB1, and FGFR3 in Feline Spermatogonial Stem Cells

精原干细胞（SSCs）在猫睾丸中FGFR3、ITGB1、CXCR4的表达模式及发育差异研究，采用免疫荧光结合ImageJ定量分析，发现ITGB1表达稳定，CXCR4在幼年阶段显著升高且定位受限，FGFR3从幼年到青春期表达位置变化但无显著差异。该研究为猫SSCs鉴定及繁殖技术发展提供分子依据。

　　

Kumsal Orkun|?zge ?ngen? ??nar|Ahmet Ceylan|Koray Tekin

土耳其安卡拉大学兽医学院动物繁殖与人工授精系

摘要

精原干细胞（SSCs）在维持雄性生育能力方面起着关键作用，它们也被越来越多地认为是保护生物学中的重要工具。然而，家猫（Felis catus）中SSCs的分子特性尚未得到充分研究。本研究旨在探讨三种候选标记物——成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）、整合素β1（ITGB1）和趋化因子受体4型（CXCR4）在青春期前和青春期猫睾丸中的免疫组化表达模式。从五只青春期前和五只青春期猫的睾丸中收集组织样本，并根据精原细胞的组织学评估进行分类。通过免疫荧光染色结合α-SMA和DAPI复染技术对冷冻切片进行分析。在荧光显微镜下评估表达模式，并使用ImageJ软件测量定量荧光强度。研究结果表明，ITGB1的表达在两个发育阶段都十分稳定且均匀分布在生精小管中，组间无显著差异（p > 0.05）。相比之下，CXCR4在青春期前睾丸中的表达显著高于青春期睾丸（p < 0.05），并在青春期后局限于基底区域。FGFR3在青春期前主要表达于生殖细胞中，而在青春期则主要表达于基底膜和精子尾部区域，组间无显著差异（p > 0.05）。这些发现为猫精原干细胞的分子特性提供了新的见解，并为开发先进的生殖技术以保护遗传多样性和濒危猫科动物的保护工作奠定了基础。

引言

精原干细胞（SSCs）是一类未分化的生殖细胞，负责终生维持精子发生[1]。除了在维持精子发生中的关键作用外，SSCs现在也被视为生殖生物技术中的重要工具，尤其是在物种保护方面[2]、[3]。

尽管在啮齿类和灵长类动物中已经对SSCs的生物学特性进行了广泛研究，但在猫科动物中的分子特性仍不明确[4]、[5]。家猫（Felis catus）是研究濒危野生猫科动物的重要模型[6]、[7]，因为许多野生猫科动物由于栖息地丧失、狩猎和遗传瓶颈而面临严重的种群下降[4]、[8]、[9]、[10]。

在出生后发育过程中，睾丸会发生显著的形态和功能变化。青春期前的猫睾丸缺乏成熟的管腔，主要由未分化的生殖细胞（如生殖细胞）组成。而青春期睾丸则具有完全分化的生精小管、血-睾屏障的形成以及完整的精子发生过程[11]。虽然已经描述了猫睾丸发育的组织学特征，但针对猫SSCs的特异性分子标记物尚未得到充分阐明。

几种表面蛋白，如成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）、整合素β1（ITGB1）和趋化因子受体4型（CXCR4），已被提出作为其他物种中的SSCs标记物[12]、[13]、[14]、[15]。FGFR3参与维持干细胞特性并调节早期生殖细胞的发育[16]。ITGB1被认为能介导细胞黏附和与生精小管基底膜的相互作用，从而维持SSCs在基底膜上的位置[17]。CXCR4与其配体SDF-1（CXCL12）相互作用，在生殖细胞的迁移、定位和归巢过程中起关键作用[12]、[18]。然而，这些标记物在猫睾丸不同发育阶段的表达动态仍很大程度上未被探索（表面标记物的补充表见原文）。

在功能研究中，这些通路对于维持雄性生育能力至关重要。CXCL12-CXCR4轴的失调会导致SSCs归巢失败、未分化生殖细胞的丢失以及移植模型中精子发生能力的下降[12]、[18]、[48]、[49]、[50]。ITGB1（β1-整合素）的缺失会破坏精原细胞与基底膜的黏附，影响Sertoli细胞与生殖细胞的相互作用，并改变生精上皮的形态[13]、[17]、[31]。FGFR3/FGF2信号通路支持SSCs的自我更新，其失调与人类研究中的生殖细胞缺陷和精子功能受损有关[14]、[16]、[46]。因此，这些通路的缺陷会导致SSCs耗竭、管状结构异常或精子活力降低[45]，凸显了它们对生育能力的重要性。尽管已在家猫和野生猫科动物中描述了PLZF、UCHL1、DDX4、DBA凝集素、SSEA抗原和FoxO1等SSCs标记物[4]、[20]、[22]、[23]、[24]、[57]、[58]、[59]、[60]、[61]、[62]，但目前尚无关于FGFR3、ITGB1或CXCR4在猫睾丸中的受体水平定位的研究。现有文献表明FGFR3在未分化的精原细胞和生殖系稳态中起重要作用[14]、[16]，ITGB1在SSCs与基底膜的黏附中起作用[13]，CXCR4在SSCs的归巢、迁移和未分化细胞池的维持中起作用[12]、[18]、[48]、[49]、[50]。然而，它们在猫科动物中的发育表达模式仍不清楚。

因此，本研究旨在检测青春期前和青春期猫睾丸中FGFR3、ITGB1和CXCR4的表达形态和免疫定位。通过免疫荧光分析结合定量图像评估来确定这些标记物的发育动态，并评估它们在识别猫精原干细胞方面的潜在用途。这种方法能够识别出特定阶段的表达谱型，并突显它们作为猫精原干细胞标记物的潜力。这些发现为基于SSCs的生殖技术的发展以及濒危猫科动物的保护工作提供了分子基础。

伦理声明

所有涉及动物组织的程序均遵循安卡拉大学动物实验地方伦理委员会的伦理标准。本研究根据协议编号2021-117和决定编号2021-19-169进行评估，由于睾丸样本是从临床目的的常规阉割手术中获得的，因此不需要特别的伦理批准。所有动物在常规阉割前均获得了所有者的书面同意。

实验设计和分组

睾丸

一般形态和分组

在评估的十个睾丸样本中，阉割与冷冻之间的时间间隔从17分钟到190分钟不等（平均：112.7分钟）。青春期组的睾丸重量（1.32 ± 0.69克）显著高于青春期前组（0.38 ± 0.15克）（p < 0.05）。睾丸的深度、长度和宽度也表现出类似的统计学显著差异（p < 0.05）。两组中均存在阴茎棘，因此不将其作为分类依据。

讨论

了解SSCs的形态和分子特性对于推进猫科动物的辅助生殖技术至关重要[20]。我们的研究首次基于免疫荧光技术比较了青春期前和青春期睾丸中FGFR3、CXCR4和ITGB1的表达情况。我们发现这些标记物表现出不同的、特定于发育阶段的定位模式，反映了它们在维持和分化SSCs中的潜在作用。

结论

我们首次证明FGFR3、ITGB1和CXCR4在猫睾丸中表现出不同的发育表达动态。ITGB1在两个阶段都表现出稳定的表达，CXCR4标记了具有常染色核的早期生殖细胞，而FGFR3的表达则从生殖细胞转移到基底细胞和精子细胞。这些观察结果扩展了非啮齿类动物中SSCs生物学的框架，并为未来的猫科动物生殖生物技术提供了依据。这些发现进一步丰富了现有的研究。

CRediT作者贡献声明

Ahmet Ceylan：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、方法学设计、研究实施、数据分析、概念构建。Koray Tekin：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金筹集、数据分析、概念构建。Kumsal Orkun：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学设计、研究实施、资金筹集、数据分析。

未引用的参考文献

[63]。

伦理声明

作者感谢安卡拉大学动物实验地方伦理委员会对研究方案的评估（方案编号：2021-117，决定编号：2021-19-169），并确认该项目无需伦理批准。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Koray Tekin表示获得了土耳其科学技术研究委员会的财政支持。如果还有其他作者，他们声明自己没有已知的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了土耳其科学技术研究委员会（TUB?TAK）在1002短期研发资助计划（项目编号：124O939）下的支持。作者在准备手稿过程中使用了基于人工智能的工具来辅助语法检查和语言润色。