在毒蛙Adelphobates galactonotus中，不同器官在将pumiliotoxin (+)-251D羟基化为allopumiliotoxin (+)-267A过程中的作用

《Toxicon》：The role of different organs in the hydroxylation of pumiliotoxin (+)-251D to allopumiliotoxin (+)-267A in the poison frog Adelphobates galactonotus

化学防御机制中，毒蛙通过代谢转化摄入的生物碱pumiliotoxin (+)-251D为更具毒性的allopumiliotoxin (+)-267A，并揭示其肝脏、皮肤及脂肪体的分布规律与代谢过程。

　　

Basil Minder | Andres E. Brunetti | Jacqueline N. Mendon?a | Rodrigo Moreira da Silva | Ralph A. Saporito | Noberto P. Lopes | Taran Grant

圣保罗大学生物科学研究所动物学系，巴西圣保罗州05508-090

摘要

化学防御是两栖动物躲避捕食者、病原体和寄生虫的关键策略。尽管两栖动物体内的大多数防御性化学物质是通过生物合成获得的，但毒蛙会从食物中吸收生物碱，并在某些情况下对其进行羟基化或N-甲基化处理，以形成更具毒性的化合物。虽然已在无尾目动物的分泌物中分离出1200多种亲脂性生物碱，但生物碱的吸收和生物转化机制仍很大程度上未知。本研究探讨了Adelphobates galactonotus物种用于吸收和转化摄入生物碱的生化途径。具体而言，我们利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法研究了口服摄入的pumiliotoxin (+)-251D被羟基化为allopumiliotoxin (+)-267A的过程。我们检测了这些生物碱在肝脏、皮肤、消化道、胆囊、肾脏和脂肪体等器官中的分布情况。通过采用固相萃取的新样品制备方法，本研究阐明了这些生物碱的转移模式及其比例差异。我们在肝脏中检测到了pumiliotoxin (+)-251D及其羟基化衍生物，表明肝脏参与了这一过程；而皮肤则是这两种生物碱的主要储存部位。此外，我们还发现这些生物碱存在于尿液和脂肪体中，这表明它们可能通过被动方式储存。

引言

毒蛙属于多个无尾目分支，其特征是具有多样的防御性化学物质、昼行性活动以及以微小生物为食的饮食习惯（Saporito等人，2012年）。迄今为止，已在南美洲蟾蜍科（Melanophryniscus）、古巴Eleutherodactylidae科（Eleutherodactylus limbatus属）、马达加斯加Mantellidae科（Mantella）、澳大利亚Myobatrachidae科（Pseudophryne）以及新热带Dendrobatoidea科（多个属）的物种中鉴定出1200多种亲脂性生物碱（Daly等人，1984年；Rodríguez等人，2011年；Garraffo等人，1993年；Tarvin等人，2024年）。由于这些生物碱的复杂性（Mebs等人，2008年；Daly等人，1992年），毒蛙成为研究的重点对象，因为它们在抵御捕食者和微生物感染方面起着关键作用（Saporito等人，2012年；Hovey等人，2018年；Toledo和Jared，1995年）。不同物种、种群和个体之间的生物碱数量和种类存在显著差异（Saporito等人，2012年；Mebs等人，2008年；Daly等人，1992年；Saporito等人，2010年；Sague等人，2023年），这些差异受到生物碱吸收能力或效率的内在差异以及地理位置（Saporito等人，2006年；Daly等人，2007年；Albuquerque-Pinna等人，2024年；Lawrence等人，2023年）、季节（Saporito等人，2007a年）、发育阶段（Saporito等人，2010年）、年龄和体型（Jeckel等人，2015年；Stynoski等人，2024年）等外在因素的影响。

与其他两栖动物的防御性化学物质不同（Porto等人，1972年），毒蛙体内的生物碱是从食物中的节肢动物中吸收的。研究表明，某些蚁类（如formicine ants）和螨虫（如oribatid mites）（Saporito等人，2004年；Saporito等人，2007b年；J.W. Daly等人，1994年；Saporito等人，2011年；Saporito等人，2015年；Takada等人，2005年）是毒蛙生物碱的主要来源，其中包括pumiliotoxin（PTX）类生物碱（Saporito等人，2012年；Saporito等人，2007b年；Saporito等人，2009年；Daly，1998年）。pumiliotoxins最初由Daly和Myers（1967年）在Oophaga pumilio中鉴定并命名，现已发现这是一类包含约50种不同pumiliotoxins和allopumiliotoxins的生物碱，还包括多种脱氧和去甲基衍生物（Michael，2016年；Daly等人，2005年）。其中最著名的PTX衍生物基于喹诺利嗪和吲哚利嗪结构，如homopumiliotoxins（hPTX）和aPTX，它们在毒蛙中非常普遍（Saporito等人，2012年；Michael，2016年）。

虽然大多数毒蛙物种能够积累生物碱而不对其进行处理，但有一部分毒蛙能够对某些亲脂性生物碱进行化学修饰（Saporito等人，2012年；Daly等人，2003年；Jeckel等人，2022年；Daly等人，1997a年；Smith等人，2002年）。例如，某些Pseudophryne（Myobatrachidae科）物种会进行还原和羟基化等修饰（Saporito等人，2012年；J. Daly等人，1994年；Daly等人，1997b年；Daly等人，2003年），并将PTX 307A转化为分子量为309、323和325的衍生物（Sague等人，2023年；Smith等人，2002年）。最近在毒蛙Dendrobates auratus、Ranitomeya ventrimaculata和A. galactonotus中也发现了脱氢喹啉（DHQ）的N-甲基化现象，后者特有于巴西南部亚马逊河流域（Jeckel等人，2022年；Daly等人，2009年；Jeckel等人，2026年）。尽管在记录生物碱多样性及其成因和后果方面取得了重大进展，但这些青蛙如何将生物碱纳入皮肤颗粒腺中的机制仍不甚明了（Santos等人，2016年；Caty等人，2019年；Alvarez-Buylla等人，2023年；Neuwirth等人，1979年）。

我们使用A. galactonotus来研究PTX 251D和aPTX 267A的积累位置和生物转化过程。与其他某些Dendrobatidae物种类似，A. galactonotus会将天然存在的对映体PTX (+)-251D转化为羟基化的aPTX (+)-267A（图1），这一生化过程对防御和药理学都有重要意义（Daly等人，2003年；Weldon等人，2006年；Weldon等人，2013年；Küpfer和Branch，1985年；Zhu等人，2022年）。这种修饰可以加速某些外源物质的排泄，通过增强解毒作用使化合物更具极性，从而更容易排出体外（Gibson和Skett，2001年）。这种转化可能有助于降低青蛙的自我毒性；然而，PTX 251D转化为aPTX 267A后，其毒性在皮下注射小鼠时增加了五倍（Daly等人，2003年），这表明其在防御中可能具有作用。喂食实验表明，某些Dendrobatidae青蛙（如A. galactonotus和A. cataneoticus）能够将摄入的PTX 251D的70%代谢为aPTX 267A（Daly等人，2003年），这表明存在负责7’-羟基化过程的酶。然而，具体酶及其活性尚未明确，且似乎仅限于某些能够吸收生物碱的物种（Alvarez-Buylla等人，2022年）；例如，在Phyllobates bicolor和Epipedobates tricolor等物种中仅检测到PTX 251D，说明这些物种可能缺乏这种酶（Daly等人，2003年；Alvarez-Buylla等人，2022年）。PTX 251D向aPTX 267A的转化不仅发生在A. galactonotus中（Daly等人，2003年），还发生在其他Dendrobatidae物种中，如Oophaga pumilio（Mebs等人，2008年；Daly等人，2003年；Caty等人，2019年）、D. tinctorius（Saporito等人，2012年；Alvarez-Buylla等人，2022年；O’Connell等人，2021年）、D. auratus、A. castaneoticus和R. ventrimaculata（Jeckel等人，2026年；Daly等人，2003年）。

我们进行了两项实验，分别针对皮肤、消化道、肝脏、胆囊、脂肪体、脾脏和肾脏，以确定负责羟基化的器官并量化其随时间的变化。为此，我们将A. galactonotus成体暴露于不同剂量的PTX 251D中，从而观察和比较各器官的代谢反应。

实验1 – 恒定剂量，变量时间

对照组（CG；SM5）未检测到生物碱。所有实验组（EG）的器官中均检测到了PTX 251D和aPTX 267A（图2）。我们发现皮肤中PTX 251D和aPTX 267A的数量呈负相关（F(1, 8) = 6.055，

讨论

本研究确定了参与PTX 251D药代动力学的主要器官，包括它们的积累和羟基化作用。在A. galactonotus中，皮肤、消化道、肝脏、胆囊、脂肪体和肾脏均含有PTX 251D和aPTX 267A。我们还在少数个体的脾脏中检测到了少量这两种生物碱；然而，由于脾脏中的生物碱含量极少，因此需要进一步实验来确定其作用机制。

结论

我们在A. galactonotus的多个器官中检测到了膳食中的PTX 251D和羟基化的aPTX 267A，包括皮肤、消化道（肠道和胃）以及肝脏，其中羟基化生物碱的积累量较高。我们首次在毒蛙的脂肪体中发现了这些生物碱，表明它们可能通过被动方式暂时储存。我们的研究结果还表明，除了储存和分泌防御性生物碱外，皮肤腺体可能还具有其他功能。

作者贡献声明

Basil Minder：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 原稿；项目管理；方法学；研究；数据分析；概念构思。 Andres E. Brunetti：撰写 – 审稿与编辑。 Jacqueline N. Mendon?a：方法学；数据分析。 Rodrigo Moreira da Silva：方法学。 Ralph A. Saporito：撰写 – 审稿与编辑；资源获取；概念构思。 Noberto P. Lopes：撰写 – 审稿与编辑；监督；资源获取；方法学；资金筹措；概念构思。

伦理声明

该研究已获得圣保罗大学生物科学研究所动物使用与护理委员会的批准（授权编号：402/2023）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

Richard W. Fitch（印第安纳州立大学化学与物理系）提供了合成的PTX (+)-251D；Jivaldo do Rosário Matos（圣保罗大学基础化学系）提供了协助并提供了热重分析设施的支持。Fabiola Almeida García、Ingrid Odermatt和Julia Albuquerque de Pinna对稿件的早期版本进行了修改。研究资金由圣保罗州研究基金会（FAPESP）提供。