《Exploration》：Antibacterial Hydrogel Dressing With Ca2+-Dependent Hyaluronidase Responsiveness for Accelerating Wound Healing via On-Demand Release of AIE Photosensitizers
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本工作报道了一种具有Ca2+依赖透明质酸酶（HAase）响应的新型聚集诱导发光（AIE）光敏剂（PSs）水凝胶敷料。它实现了AIE PSs（TTPy-NH2）的按需释放与活性氧（ROS）的智能调控，在高效清除细菌的同时最大程度减少了对正常组织的损伤，并通过体内实验证实能显著加速感染伤口愈合。该研究首次揭示了Ca2+对HAase活性的双向调控机制，为开发智能、精准的抗菌敷料提供了新策略。
1 引言
细菌感染的伤口护理在全球范围内疾病负担沉重，而抗生素的滥用导致了耐药菌感染的出现。活性氧（ROS）辅助的光动力抗菌作为一种有效的非抗生素方法受到广泛关注，但过量ROS会对正常组织造成无差别损伤，因此光敏剂（PSs）的按需释放是迫切需求。聚集诱导发光（AIE）PSs因其在聚集状态下独特的聚集增强诊疗（AET）特性，展现出高效的ROS生成能力，是理想的光动力抗菌剂。水凝胶因其优异的组织粘附性、吸水性和响应性等特点，被广泛用作伤口敷料和药物载体。结合AIE PSs与水凝胶的优势，有望为感染伤口愈合带来新范式。然而，大多数已报道的负载AIE PSs的水凝胶敷料主要依赖于水凝胶的自然降解来不可控地释放PSs，难以适应伤口的动态微环境。因此，开发能够按需释放AIE PSs的水凝胶敷料，在确保完全杀菌的同时最小化ROS过度产生带来的副作用至关重要。
2.1 AIE光敏剂（TTPy-NH2）的合成与表征
本研究合成了一种由三苯胺（TPA）片段、噻吩单元、碳碳双键和吡啶鎓部分组成的化合物TTPy-NH2作为AIE PSs。密度泛函理论（DFT）计算显示其电子带隙（Eg）较小（2.184 eV），单重态-三重态能隙（ΔEST）显著减小（0.1334 eV），这为高效ROS生成提供了理论支持。TTPy-NH2在可见光区有强吸收，并在663 nm处有满意的远红/近红外发射。在甲醇/甲苯溶剂体系中，其光致发光（PL）强度在甲苯分数（fT）超过70%后急剧增强，最终在fT为99%时达到最大值，超过100倍的PL增强和近3倍的荧光寿命增长证实了其典型的AIE行为。使用二氯二氢荧光素（DCFH）作为指示剂的实验表明，在可见光照射下，TTPy-NH2存在时DCFH的荧光强度迅速增强，其总体ROS生成能力优于市售的Ce6。这些结果证实TTPy-NH2是一种高性能的AIE PSs，适用于后续构建负载AIE PSs的水凝胶敷料。
2.2 可切换抗菌水凝胶（SAH）的设计与表征
设计理念：受病原菌通常分泌透明质酸酶（HAase）以“侵蚀”细胞外基质（如透明质酸HA）并更深感染的机制启发，选择HA作为敷料的响应部分，以实现基于感染程度的PSs按需释放。选择海藻酸钠（SA）辅助凝胶形成，因为它可在生理条件下被Ca2+轻松交联。重要的是，Ca2+还可作为HAase活性的调节剂。因此，使用HA和SA作为水凝胶基质，并以Ca2+作为交联剂和HAase活性调节剂，可以设计出具有Ca2+依赖性HAase响应性和按需释放AIE PSs能力的SAH。
物理化学性质：SAH的制备首先将TTPy-NH2负载到HA中，然后与SA混合形成前驱体溶液，最后通过高浓度CaCl2溶液交联形成最终敷料。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和Zeta电位分析证实TTPy-NH2通过分子间氢键成功负载到HA聚合物链上，而非简单混合。流变学表征表明，Ca2+交联后的SAH转变为类固体材料，弹性模量（G'）占主导地位，表现出紧密交联的弹性网络。扫描电子显微镜（SEM）显示SAH具有完整、相互连通的多孔微结构，优化的孔隙分布有利于伤口渗出液管理和氧气/营养扩散。力学测试显示其压缩模量和拉伸模量分别为48.5 ± 19.4 kPa和134.5 ± 12.5 kPa，具有出色的弹性恢复能力，适合作为伤口敷料。
释放行为：Ca2+从SAH中的释放持续增加，24小时检测到10 mM Ca2+，释放曲线与HAase存在与否无关。HAase活性研究表明，当Ca2+浓度低于10 mM时，HAase活性随Ca2+浓度增加而增强，在10 mM时达到最大；超过10 mM则活性被抑制。与此对应，在前24小时，由于HAase活性升高，SAH降解和TTPy-NH2释放逐渐增强；24小时后，高浓度Ca2+开始使HAase失活，TTPy-NH2释放进入平台期。而无HAase存在的SAH组则表现出持续但慢得多的降解和更少的TTPy-NH2释放。回归分析显示，水凝胶在不同液体环境中的溶胀率与TTPy-NH2释放动力学之间相关性极低（R2< 0.1），表明溶胀介质的质量转移不是主要的释放机制。这些结果有力地证明了所设计SAH的Ca2+依赖性HAase响应性以及HAase活性依赖的TTPy-NH2释放。
生物相容性：在黑暗条件下，TTPy-NH2本身对小鼠成纤维细胞L929具有良好的生物相容性。在光照下，TTPy-NH2表现出光毒性，细胞活力随浓度增加而下降。SAH敷料本身（主要成分为FDA批准的HA和SA）在仅有HAase或仅有光照的条件下对细胞无毒性。值得注意的是，即使在HAase和光照同时存在的情况下（此时ROS生成增强），不同时间点的细胞活力仍保持在90%以上。这归因于SAH的自我限制释放机制：Ca2+的持续释放逐渐抑制了TTPy-NH2在24小时后的进一步扩散，将ROS产生限制在不足以对哺乳动物细胞产生细胞毒性光动力效应的水平，同时可能保留了杀菌效力。此外，SAH在所有测试体积下溶血率均低于5%的生物相容性阈值，验证了其适用于伤口护理中的直接血液接触。
2.3 Ca2+对HAase调控机制的探索
圆二色（CD）光谱用于监测HAase与不同浓度Ca2+溶液相互作用时的二级结构。分析显示，HAase的主要二级结构为α-螺旋、β-折叠和β-转角。当Ca2+浓度在0至80 mM范围内变化时，α-螺旋（被认为是最稳定和刚性的二级结构）的含量先增加后减少，在10 mM时观察到最高的α-螺旋含量（24.3%）。相反，较松散的β-折叠则呈现相反趋势。α-螺旋的比例与HAase活性呈正相关。
分子对接研究进一步确定了Ca2+与HAase的结合位点。Ca2+被对接到位于HAase中间的一个螺旋空腔中，并与蛋白质的Thr-163、Leu-164、Asp-170、Asp-171和Phe-172氨基酸上的O原子形成六配位相互作用，这首次提示了Ca2+与HAase之间存在配位键，为Ca2+增强HAase构象稳定性的能力提供了进一步解释。
通过软件分析，在HAase的三级结构中发现大量疏水性氨基酸和10个疏水簇。根据先前研究，当高浓度Ca2+（作为强电解质）优先与蛋白质内的H2O分子结合时，这些簇容易暴露并通过疏水相互作用导致HAase盐析。三维荧光光谱进一步验证了这一点：当Ca2+浓度超过10 mM时，在峰2处出现众多异质且宽的峰，明显暗示了蛋白质分子的盐沉淀。
综上所述，基于分子模拟和实验结果可以得出结论：低浓度Ca2+通过稳定HAase的空间结构来提高其活性，这种稳定是通过刺激HAase转化为其优选构象并与HAase形成配位键实现的。相反，高浓度Ca2+（>10 mM）导致HAase盐沉淀，使其失活。
2.4 SAH的体外抗菌活性
在评估抗菌活性之前，确认了TTPy-NH2与大肠杆菌（E. coli，革兰氏阴性菌代表）、金黄色葡萄球菌（S. aureus，革兰氏阳性菌代表）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，多重耐药菌代表）的强结合亲和力。与TTPy-NH2孵育15分钟后，所有三种细菌均发出明亮的红色荧光。
抗菌效率测试显示，当TTPy-NH2浓度达到2 μg/mL时，S. aureus和MRSA的繁殖被完全抑制；对于E. coli，则需要高于3 μg/mL的TTPy-NH2浓度。保持在黑暗中的对照组没有明显的杀菌活性。所有细菌分泌的HAase浓度与其浓度呈正相关，即使在低细菌浓度（102CFU/mL）下，分泌的HAase浓度也足以触发TTPy-NH2的释放。
抑制区实验表明，仅用三滴水凝胶即可完全消除整个培养物。测试SAH在高（107CFU/mL）和低（103CFU/mL）细菌浓度下的光动力抗菌效率（根据世界卫生组织WHO标准，高于103CFU/mL通常被视为感染浓度）。在低细菌浓度下，SAH仍能在4小时内释放足够的TTPy-NH2完全杀死所有三种细菌。然而，当细菌浓度高时，需要更长时间（8小时）积累更多释放的TTPy-NH2来清除MRSA。总体而言，制备的敷料表现出优异的抗菌效果。
2.5 体内伤口愈合
建立全层皮肤感染伤口模型以评估SAH促进伤口愈合的效率。实验组设置为：仅伤口、3M胶带（伤口覆盖商业胶带）、TTPy-NH2、不含TTPy-NH2的SAH（仅水凝胶）和SAH（负载TTPy-NH2的水凝胶）。所有组均接受光照。仅伤口组出现撕裂和化脓，表明严重感染。3M胶带组和TTPy-NH2组的伤口愈合情况较仅伤口组有所改善。对于不含TTPy-NH2的SAH组和SAH组，在治疗期间伤口区域未出现黄色脓液，伤口保持湿润直至形成痂。在愈合率方面，两个水凝胶组表现出比其他三组更快的愈合，SAH组最先达到完全的伤口愈合率。
苏木精-伊红（H&E）染色显示，在第七天，仅伤口组、3M胶带组和TTPy-NH2组有明显结痂，不含TTPy-NH2的SAH组有小结痂，SAH组结痂可忽略不计。到第14天，只有SAH组显示出显著愈合，并拥有最完整的再生皮肤附属器，如毛囊。值得注意的是，TTPy-NH2组表现出广泛的组织坏死和局灶性钙化，特别是在邻近的结缔组织中，暗示过量的ROS可能阻碍正常的愈合过程。SAH组再生的表皮层比其他组更均匀，厚度为23.3 ± 8.0 μm，最接近健康皮肤的厚度，表明SAH组具有优越的皮肤再上皮化。
抗菌效果：从伤口部位收集组织液进行培养。经SAH处理的组在第1天细菌被完全根除。而不含TTPy-NH2的SAH组需要4天才能消除细菌。当TTPy-NH2直接添加到受伤组织时，尽管在第1天杀死了所有细菌，但似乎不如SAH组有效。
炎症与增殖评估：肿瘤坏死因子α（TNF-α）是伤口愈合炎症反应阶段的代表因子。在第7天，SAH组的TNF-α表达水平显著高于其他组，表明更多的中性粒细胞和单核细胞被募集到伤口部位并分化为炎症表型巨噬细胞（M1）。随后，在第14天，SAH组的TNF-α表达显著下调，这有利于伤口愈合。同时，作为促进伤口愈合再生阶段的关键抗炎细胞因子，白细胞介素-10（IL-10）在第14天于SAH组的表达高于其他组。从第7天到第14天炎症环境的变化表明伤口在第14天已过渡到增殖阶段。使用Ki67免疫染色评估肉芽组织形成期间的细胞增殖活性。SAH组的Ki67表达在第7天显著较高，但在第14天明显低于所有其他组，这表明伤口从增殖阶段进展到重塑阶段，并且第14天Ki67的降低也提示了对异常组织增殖的抑制。
重塑过程评估：Masson三色染色用于评估伤口组织中胶原的形成。在第14天，两个水凝胶组（第4组和第5组）的胶原沉积显著高于TTPy-NH2组。作为评估血管化的典型标志物，血小板-内皮细胞粘附分子1（CD31）的表达在第14天于SAH组显著升高，证明SAH在促进感染伤口血管生成方面具有优势。在伤口愈合过程中，活化的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并以新表达的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）为标志。通常在伤后约一周开始形成肉芽组织。分析α-SMA的表达，在第7天，第4组和第5组观察到高水平，其中SAH组的表达最为明显，表明伤口闭合更快。此外，在第14天，SAH组的α-SMA水平与其他组相比显著下降，这可能是由于SAH组肉芽组织形成减少，促进了伤口重塑。
总体而言，SAH凭借其按需释放TTPy-NH2的有利能力，在促进伤口愈合方面表现出卓越的功效。此外，它还合理地调节炎症和抗炎过程，并加速伤口的细胞增殖和重塑阶段。
3 结论
总之，我们成功设计了一种新型抗菌水凝胶，该水凝胶通过Ca2+依赖性HAase响应机制，能够按需释放AIE PSs，用于治疗感染伤口。该伤口敷料是通过将抗菌TTPy-NH2掺入由HA和SA组成的聚合物水凝胶网络中，并在Ca2+溶液中交联制成的。当暴露于浓度低于10 mM的Ca2+时，HAase倾向于采用更稳定的构象，α-螺旋含量增加，并与Ca2+形成配位键，最终促进HAase的活性。然而，Ca2+浓度超过10 mM会导致HAase盐沉淀和失活。Ca2+依赖性HAase响应性赋予所得SAH按需释放TTPy-NH2的优势能力，这既能在初始阶段实现足够的AIE PSs释放以清除细菌，也能及时启动关闭机制，以防止不必要的细胞毒性和过量ROS造成的损伤。凭借所有这些有益特性，SAH在S. aureus感染的全层皮肤伤口模型中展示了促进伤口愈合的优异性能。值得一提的是，这项工作首次报道了HAase的Ca2+依赖性响应，并借助分子建模和光谱分析进一步阐明了相应的调控机制。此外，我们相信所开发的水凝胶敷料作为下一代基于ROS的抗菌伤口敷料在临床应用中具有巨大潜力。
