《Plant Signaling & Behavior》：Maize ZmbZIP92 transcription factor positively regulates drought tolerance in Arabidopsis
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本研究通过比较基因组学从玉米中鉴定到一个新的bZIP转录因子基因ZmbZIP92。该基因受干旱、高盐及脱落酸(ABA)显著诱导，定位于细胞核并能特异性结合G-box顺式元件。在拟南芥中异源过表达ZmbZIP92可显著促进根系伸长，增强耐旱性，并提高对ABA的敏感性。转录组分析表明，ZmbZIP92通过调控ABA信号转导、抗氧化反应及跨膜运输等途径，正向调控植物的干旱胁迫响应，为培育抗旱作物提供了潜在的基因资源。
ZmbZIP92被鉴定为玉米中一个新的bZIP基因
水稻中参与干旱胁迫响应的OsbZIP62基因的同源物通过比较基因组分析在玉米中被鉴定，命名为ZmbZIP92。该基因编码的蛋白质被归类于玉米11个bZIP亚类中的第I亚组，包含用于结合DNA的碱性区域和介导蛋白质二聚化的亮氨酸拉链结构域。进化树分析显示，玉米ZmbZIP92与水稻OsbZIP62及高粱Sobic-002G425600亲缘关系密切，暗示其可能编码一个调控玉米耐旱性的因子。相关图示展示了ZmbZIP92的系统发育树及多序列比对结果，其保守的bZIP和DNA结合结构域清晰可见。
ZmbZIP92表达模式分析
通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了ZmbZIP92在不同玉米组织中的表达谱及其对脱落酸(ABA)、氯化钠(NaCl)、PEG-6000(模拟干旱胁迫)和高温(42oC)处理的响应。数据显示，所有测试的非生物胁迫均能诱导ZmbZIP92表达，表现为快速上升后逐渐下降的趋势。在组织特异性表达方面，ZmbZIP92的转录本丰度在根、叶、胚和胚乳中相对较高，而在八叶期的茎和开花期的花丝中则较低。
ZmbZIP92的亚细胞定位与转录自激活分析
为确定ZmbZIP92的亚细胞定位和分子特性，将其不含终止密码子的编码序列与绿色荧光蛋白(GFP)编码序列融合构建表达载体，随后在本氏烟草叶片中进行瞬时表达。ZmbZIP92-GFP融合蛋白发出的绿色荧光定位于烟草叶细胞的细胞核，其荧光信号与核定位信号-mCherry标记的核区空间分布高度重叠，而单独的GFP荧光则在细胞核和细胞膜中均被检测到。因此，ZmbZIP92是一种核蛋白。为了分析ZmbZIP92的转录自激活能力，将其全长编码序列克隆到pGBKT7载体并转化酵母细胞。携带pGBKT7-ZmbZIP92的酵母细胞与阴性对照一样，无法在含有X-α-gal的SD/?Trp/?His/?Ade选择培养基上生长，反映了在实验条件下其缺乏转录自激活活性。
ZmbZIP92特异性结合G-box元件
G-box(核心序列：CACGTG)是bZIP转录因子的一个保守结合位点。为了确定ZmbZIP92是否特异性结合此顺式调控元件，构建了重组载体pGreenII 62-SK-ZmbZIP92和pGreenII 0800-G-box进行双荧光素酶报告基因检测。实验组(62-SK-ZmbZIP92和0800-G-box)检测到显著的荧光素酶发光信号，而任何对照组均未检测到，这表明ZmbZIP92特异性结合G-box元件。
ZmbZIP92过表达增强了拟南芥的抗旱性
构建了在CaMV 35S启动子控制下过表达ZmbZIP92的转基因拟南芥植株。通过PCR和qRT-PCR鉴定出三个独立的转基因株系，其中L5株系的ZmbZIP92表达水平最高。选择L4、L5和L10株系用于后续分析。干旱胁迫对野生型(WT)和ZmbZIP92过表达植株均产生了不利影响(生长受抑制、萎蔫、叶片黄化)。重新浇水后，转基因植株几乎完全恢复，而野生型植株的恢复则严重受损，这反映了转基因植株增强的耐旱性。生理分析进一步揭示，在干旱条件下，与野生型植株相比，转基因植株具有更高的过氧化物酶(POD)活性和叶片相对含水量(RWC)。此外，它们积累了更少的活性氧(ROS)，具有更低的丙二醛(MDA)含量。在甘露醇模拟的干旱条件下，野生型和转基因植株的根系生长均受到抑制。然而，在200和300 mM甘露醇处理下，ZmbZIP92过表达植株的根系显著长于野生型植株，进一步支持了它们对干旱类似条件的耐受性提高。相关图片展示了干旱胁迫及复水后的表型对比，以及POD活性、RWC和MDA含量的生理指标数据。
ZmbZIP92过表达拟南芥表现出增强的ABA敏感性
外源ABA处理能快速诱导ZmbZIP92表达。为了评估这种诱导是否改变了ABA响应性，比较了野生型和转基因植株在0.5或1 μM ABA处理下的种子萌发率。在两种ABA浓度下，ZmbZIP92过表达株系的萌发抑制程度均显著高于野生型对照。因此，ZmbZIP92过表达似乎增加了拟南芥对ABA的敏感性。相关图表统计了不同ABA浓度下的萌发率。
ZmbZIP92通过ABA信号通路介导干旱响应
对遭受干旱胁迫的野生型和L5转基因拟南芥植株进行了转录组分析。在通过主成分分析确认样本一致性和测序数据质量后，共鉴定出7405个差异表达基因，其中4922个基因在转基因植株中表达上调，2483个基因表达下调。通过功能注释筛选出28个与ABA信号传导和胁迫适应相关的基因。聚类分析表明，其中16个基因在干旱条件下表达上调，12个基因表达下调。功能注释显示，上调基因包括参与ABA相关通路的ASPG1(AT3G18490)和RCAR3(AT5G53160)，以及编码跨膜水转运调节蛋白的PIP2A(AT3G53420)、PIP1;5(AT4G23400)、PIP1C(AT1G01620)、PIP2B(AT2G37170)、PIP3(AT4G35100)和TIP2;2(AT4G17340)等。而下调基因(如AT3G02140、AT3G11410等)据报道与ABA抑制性响应有关。这些基因表达的下调可能有助于ABA积累和增强耐旱性。这些发现共同表明，ZmbZIP92可能通过调节ABA相关信号通路和协调参与胁迫适应及水分稳态的关键调节基因的表达来增强耐旱性。
讨论
作为全球最重要的粮食、饲料和能源作物之一，玉米容易受到干旱胁迫的影响，导致严重的产量和品质损失。越来越多的证据表明，多种基因类型参与植物干旱胁迫响应，以减轻干旱对生长发育的不利影响。bZIP转录因子是植物响应盐分、干旱和极端温度等非生物胁迫的关键调节因子。在植物中，bZIP转录因子由一个相对较大的基因家族编码。先前的研究已鉴定出170个bZIP转录因子(由125个基因编码)，根据它们与拟南芥和水稻同源物的系统发育关系被分为11个亚家族。本研究基于与水稻OsbZIP62(正向调节水稻耐旱性)的同源性，鉴定出玉米干旱响应相关基因ZmbZIP92。拟南芥中间源物EEL也被报道可增强耐旱性。
表达谱分析表明，ZmbZIP92在根、叶和特定组织中表达，在三叶期的根和叶中转录本丰度达到峰值。ZmbZIP92的表达受到多种非生物胁迫和外源ABA的显著诱导，尤其是干旱和ABA，表明该基因可能编码一个在非生物胁迫响应中具有关键功能的蛋白质。ZmbZIP92的核定位进一步支持了其作为典型bZIP转录因子的鉴定。尽管在酵母中未检测到ZmbZIP92的转录自激活活性，但这与OsbZIP62和OsbZIP46的报道类似，暗示它们可能存在共同的保守调控机制。
为阐明ZmbZIP92在干旱条件下的功能，获得了ZmbZIP92过表达的转基因拟南芥植株。甘露醇处理促进了转基因植株的根系伸长，随后的水分亏缺胁迫试验显示其耐旱性显著提高。因此，ZmbZIP92的表达似乎对植物适应干旱胁迫的响应很重要。转基因植株增强的胁迫耐受性表现为POD活性和RWC的增加以及MDA含量的降低。这些发现共同表明，ZmbZIP92过表达赋予植物更强的耐旱性，这归因于其对干旱胁迫响应的正向调节。因此，ZmbZIP92作为一个正向调节干旱胁迫响应的转录因子发挥作用；其生物学功能与其水稻直系同源物OsbZIP62是保守的。转录因子主要通过结合下游靶基因的启动子区域来调节其表达，从而使植物适应各种外界胁迫。本研究确定ZmbZIP92能够结合下游靶基因的G-box元件并介导其表达。基于RNA测序数据鉴定了可能受ZmbZIP92调控的基因。根据显著富集的GO条目，所鉴定的7405个差异表达基因与对ABA、盐胁迫、水分剥夺和氧化胁迫的响应相关。KEGG通路分析表明，大多数差异表达基因参与MAPK信号通路和植物激素信号转导。因此，这些基因可能有助于拟南芥对干旱胁迫的适应性响应。ZmbZIP92的表达受ABA施用显著诱导，相应的转基因植株表现出对外源ABA增加的敏感性。这表明ZmbZIP92可能并非均一地放大ABA信号传导的所有下游效应，而是在胁迫条件下优化植物资源分配。
ABA敏感性的增加使植物能够相对较早和迅速地启动基本的防御反应，如气孔关闭。更重要的是，在整合转录组数据后，我们推测ZmbZIP92优先激活与胁迫适应直接相关的ABA响应基因，包括与水分保持和ROS清除相关的基因。同时，ZmbZIP92可能对强烈抑制细胞生长和扩张的ABA信号传导影响有限。这种对ABA信号通路下游的差异性调节使植物能够在干旱条件下优先保证生存，从而增强整体抗逆性，而无需付出过高的生长代价。然而，由于缺乏直接的结合证据，目前尚不清楚已鉴定的差异表达基因是否由ZmbZIP92直接靶向。或者，观察到的这些基因表达的变化可能是调控网络内的间接响应。这种可能性降低了ZmbZIP92结合G-box启动子元件并激活下游基因表达的直接机制证据。
尽管在拟南芥中的异源表达分析表明ZmbZIP92参与了ABA依赖的干旱响应，但该转录因子在玉米中是否以类似方式发挥作用仍有待确定。单子叶植物独特的调控网络可能会改变ZmbZIP92的分子机制或靶基因特异性。未来需要通过玉米的功能缺失和功能获得分析来进行明确的功能验证。
结论
本研究对玉米bZIP转录因子ZmbZIP92进行了功能鉴定。系统发育分析将其归类为bZIP家族的第I组成员，同时也揭示了其与拟南芥和水稻bZIP蛋白的同源性。亚细胞定位证实ZmbZIP92是一种核蛋白。此外，ZmbZIP92的表达受盐分和干旱等非生物胁迫诱导。尽管全长蛋白缺乏转录自激活活性，但它被观察到能特异性结合G-box顺式元件。在干旱条件下，过表达ZmbZIP92的拟南芥植株表现出增强的耐旱性，其特征是叶片相对含水量(RWC)和过氧化物酶(POD)活性显著增加，以及丙二醛(MDA)积累减少。此外，ZmbZIP92过表达植株比野生型植株对ABA更敏感。分子分析表明，在响应干旱胁迫时，ZmbZIP92过表达调节了关键ABA信号通路基因的表达，同时上调正调节因子并下调负调节因子。总之，研究数据表明ZmbZIP92正向调节玉米的干旱胁迫响应，同时也为解析玉米耐旱机制提供了重要的分子见解。
