《Redox Report》：Ligustroflavone alleviates chronic kidney disease by inhibiting ferroptosis through the GSK3β/NRF2 signaling pathway
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本篇研究聚焦于慢性肾脏病（CKD）的病理进展，揭示了天然黄酮化合物女贞子黄酮（ligustroflavone）在体内（UUO和FAN模型）和体外（erastin诱导）实验中，通过直接作用并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β），激活核因子E2相关因子2（NRF2）信号通路，上调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达，从而显著减轻肾小管上皮细胞（RTECs）的铁死亡（ferroptosis），改善肾纤维化，为CKD的治疗提供了新的潜在药物靶点和干预策略。
引言
慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease, CKD）影响着全球至少10%的人口，其特征是肾功能逐渐下降，最终可能发展为尿毒症，并与心血管疾病风险增加相关。肾小管上皮细胞（Renal Tubular Epithelial Cells, RTECs）的死亡是CKD进展的关键病理机制之一。近年来，铁死亡（ferroptosis）——一种由铁依赖的脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式——被证实与肾小管变性密切相关，成为CKD干预的潜在靶点。核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）是关键的抗氧化转录因子，而糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β）可通过磷酸化NRF2促进其泛素化降解。GSK3β/NRF2通路是调节细胞氧化还原稳态的关键通路。女贞子黄酮（Ligustroflavone, LIG）是从女贞子中提取的黄酮类化合物，据报道具有抗炎、抗氧化和抗纤维化等多种生物活性。本研究旨在探究女贞子黄酮在CKD中的保护作用及其潜在的分子机制。
研究方法
本研究采用了体内和体外实验相结合的策略。在体内部分，研究人员构建了单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction, UUO）和叶酸诱导肾病（Folic Acid-induced Nephropathy, FAN）两种小鼠CKD模型。将小鼠随机分为假手术组、模型组、女贞子黄酮+假手术组、女贞子黄酮+模型组，女贞子黄酮以每日30 mg/kg体重的剂量通过灌胃给予。在体外部分，使用小鼠肾小管上皮细胞（MPTCs），并用铁死亡诱导剂erastin进行处理。通过蛋白质印迹（Western Blotting, WB）、定量实时逆转录聚合酶链反应（Quantitative Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）、免疫荧光（Immunofluorescence, IF）和免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）等技术，在体内和体外评估肾小管损伤、纤维化、炎症、氧化应激及铁死亡相关指标。此外，还使用了CCK-8、LDH释放、Edu增殖、TUNEL凋亡、BODIPY-C11脂质过氧化探针、铁含量测定、细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）等多种实验方法，并利用分子对接软件预测了女贞子黄酮与GSK3β的潜在结合。
研究结果
1. 女贞子黄酮减轻UUO小鼠的肾小管损伤和肾纤维化
与假手术组相比，UUO小鼠肾脏表现出明显的结构异常，包括肾小管管腔扩张和刷状缘脱落。女贞子黄酮治疗显著减轻了这些损伤。天狼星红染色显示，UUO小鼠肾间质胶原沉积（纤维化）显著增加，而女贞子黄酮治疗显著减少了细胞外基质沉积。免疫荧光和蛋白质印迹分析进一步证实，女贞子黄酮有效抑制了UUO诱导的胶原I（COL1A1）、纤连蛋白（fibronectin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin, α-SMA）等纤维化相关蛋白的表达上调。
2. 女贞子黄酮改善由输尿管梗阻引起的RTECs炎症和死亡
TUNEL染色显示，UUO肾脏中RTECs凋亡显著增加，女贞子黄酮给药显著减少了细胞死亡。蛋白质印迹分析表明，女贞子黄酮逆转了UUO诱导的肾损伤标志物肾损伤分子-1（Kidney Injury Molecule-1, KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin, NGAL）的表达上调。IHC染色显示，UUO肾脏中F4/80阳性的巨噬细胞浸润显著增加，女贞子黄酮治疗显著减少了巨噬细胞浸润。qRT-PCR分析证实，女贞子黄酮显著降低了UUO肾脏中促炎细胞因子白介素1β（IL1β）、白介素6（IL6）、肿瘤坏死因子α（TNFα）和单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的表达。
3. 女贞子黄酮激活GSK3β/NRF2通路
分子对接预测显示，女贞子黄酮可直接与GSK3β结合。CETSA实验进一步证实，女贞子黄酮处理引起了GSK3β热熔曲线的右移，表明其与GSK3β存在直接结合。在MPTCs中，女贞子黄酮处理显著降低了GSK3β在Tyr216位点的磷酸化水平，表明抑制了GSK3β的活性，同时上调了NRF2及其下游靶基因血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1, HO-1）的表达。免疫荧光分析证实，女贞子黄酮促进了NRF2的核转位。在体实验中，灌胃给予女贞子黄酮7天有效抑制了肾组织中GSK3β的活性，并增强了近端小管标记物LTL与NRF2的共定位。
4. 女贞子黄酮预防UUO引起的肾小管间质铁死亡
在UUO小鼠模型中，肾脏可螯合Fe2+含量显著升高，谷胱甘肽（Glutathione, GSH）/氧化型谷胱甘肽（Glutathione Disulfide, GSSG）比值降低，丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平升高，长链脂酰辅酶A合成酶4（Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 4, ACSL4）和前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, PTGS2）的mRNA表达上调。女贞子黄酮治疗逆转了所有这些铁死亡相关指标的变化。蛋白质印迹分析显示，女贞子黄酮降低了UUO诱导的p-GSK3β表达，同时上调了NRF2和GPX4蛋白水平。IHC染色表明，UUO显著增加了脂质过氧化终产物4-羟基壬烯醛（4-Hydroxynonenal, 4-HNE）的表达，而女贞子黄酮治疗使其恢复正常水平。透射电镜观察发现，UUO肾脏线粒体出现严重的结构损伤，包括嵴解体、萎缩和膜破裂，女贞子黄酮治疗减轻了线粒体损伤。
5. 女贞子黄酮通过GSK3β通路预防MPTCs的铁死亡
在体外，erastin处理降低了MPTCs的细胞活力，增加了LDH释放和MDA积累，降低了GSH/GSSG比值，并导致BODIPY-C11荧光探针从红色（还原态）向绿色（氧化态）转变，表明发生了脂质过氧化和铁死亡。女贞子黄酮以浓度依赖性的方式（最佳浓度20 μM）减轻了erastin诱导的这些细胞毒性作用，恢复了细胞活力，并抑制了脂质过氧化。当在MPTCs中敲低GSK3β后，女贞子黄酮未能挽救erastin处理导致的细胞活力下降，这表明女贞子黄酮的抗铁死亡作用依赖于GSK3β通路。此外，用erastin处理的MPTCs的培养上清液能够促进大鼠肾成纤维细胞NRK-49F的增殖（Edu阳性细胞增加）和α-SMA表达上调（肌成纤维细胞活化），而用女贞子黄酮和erastin共同处理的MPTCs上清液则显著抑制了NRK-49F的活化和增殖。
6. 女贞子黄酮在FAN小鼠模型中减轻CKD进展
在另一种稳定的CKD模型——FAN模型中，女贞子黄酮同样极大地减轻了由叶酸引起的肾小管周围胶原沉积，并显著降低了FAN组中强烈诱导的纤连蛋白和α-SMA的表达，证实了女贞子黄酮在FAN诱导的CKD中也具有减少肾纤维化和改善铁死亡相关损伤的作用。
讨论与结论
本研究首次报道了女贞子黄酮在慢性肾脏病中对铁死亡的抑制作用及其机制。研究表明，女贞子黄酮通过直接结合并抑制GSK3β的活性，阻断其对NRF2的磷酸化和降解，从而促进NRF2核转位，上调包括GPX4在内的下游抗氧化基因的表达。这一过程有效抑制了肾小管上皮细胞中铁依赖的脂质过氧化积累，减轻了细胞铁死亡，进而减少了炎症细胞浸润、细胞外基质沉积和肾纤维化，最终在UUO和FAN两种CKD动物模型中发挥了肾脏保护作用。尽管本研究尚未通过实验直接证实女贞子黄酮与GSK3β的物理结合，但多项证据强烈支持这一作用机制。这些发现不仅拓展了女贞子黄酮已知的抗炎、抗氧化药理活性，更重要的是，明确了其通过GSK3β/NRF2/GPX4轴抑制铁死亡是缓解CKD的关键分子途径，为将女贞子黄酮开发为治疗CKD的潜在新型药物提供了坚实的临床前实验依据和理论支撑。
