《RNA Biology》：Optimizing protocols for MicroRNA profiling of infant and Toddler Stool
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本文系统比较了不同RNA保存液和提取试剂盒对婴儿及幼儿（<2岁）粪便样本中MicroRNA (miRNA) 检测质量的影响，旨在确定此类非侵入性生物标志物研究的最佳实验方案。
背景
MicroRNAs (miRNAs) 是一类长度为19至24个核苷酸的小型非编码RNA，通过转录后RNA干扰等基因沉默途径调控基因表达，影响多种发育和生理过程。研究表明，单个miRNA可靶向多个基因，而单个基因也可受多个miRNA调控。miRNA的失调与多种疾病和儿童健康状况相关，使其成为潜在的诊断工具。粪便作为非侵入性样本来源，在儿童健康研究中具有重要意义，特别是可用于探索发育中的微生物组等关键领域。然而，从婴儿和幼儿粪便中稳定提取高质量RNA用于miRNA检测面临诸多挑战，例如样本中存在大量核糖核酸酶 (RNases) 和PCR抑制剂（如胆红素），可能导致RNA降解或影响下游测序。目前，针对婴幼儿粪便样本，尚无研究系统比较不同保存方法和提取试剂盒对miRNA分析结果的影响。
方法
本研究分为两个阶段。第一阶段旨在比较不同提取试剂盒和保存方法的RNA质量。共从8名婴幼儿（4-19个月大）中收集了58份粪便样本（对应34份独立样本）。测试了三种市售RNA提取试剂盒：Zymo BIOMICs RNA Miniprep (BIOMICs)、Quick-RNA Fecal/Soil Microbe Microprep Kit (Quick-RNA) 和 Stool Total RNA Purification Kit (Norgen)。同时，比较了四种粪便保存条件：使用RNAlater溶液、Zymo DNA/RNA Shield (Shield) 保存管、Norgen Stool Nucleic Acid Collection and Preservation Tubes (NPS) 保存管，以及不使用任何保存剂 (No Preservative)。所有样本均从尿布中采集，并立即转移至相应保存管中，随后储存于-80°C冰箱直至处理。RNA质量通过片段分析仪以RNA质量数 (RNA Quality Number, RQN) 进行评估。
第二阶段旨在比较高RNA质量方案下的miRNA谱。基于第一阶段结果，选取了两种表现最佳的保存方法（RNAlater和Shield）。从4名婴幼儿（4-21个月大）的同一份粪便样本中收集成对的等分样本，分别放入这两种保存液中，随后均使用BIOMICs试剂盒进行RNA提取。提取的RNA通过小RNA测序 (smRNA-seq) 进行miRNA分析。原始数据经过处理，使用Centrifuger和kneaddata工具区分人类和微生物来源的读段。人类读段随后比对至miRBase数据库 (版本22.1) 以鉴定miRNA。进行统计分析和基因集富集分析 (GSEA) 以比较不同保存方法的差异，并探索检测到的丰富miRNA的潜在生物学功能。
结果
第一阶段：提取试剂盒与保存方法的比较
在比较的三种提取试剂盒中，Zymo BIOMICs试剂盒提取的RNA质量最高，其中位RQN为9.4（范围：5.7-10.0），显著高于Quick-RNA试剂盒（中位RQN 2.2）和Norgen试剂盒（中位RQN 1.2）。
在四种保存方法中，RNAlater的RNA质量最高，中位RQN为9.8（范围：5.7-10.0），Shield次之，中位RQN为9.4（范围：2.0-10.0），两者之间无统计学显著差异 (p = 0.47)。而NPS（中位RQN 6.7）和无保存剂（中位RQN 2.5）的RNA质量显著低于前两者。
第二阶段：高质量RNA方案的miRNA谱比较
对4对来自不同儿童的粪便样本进行小RNA测序分析。总体测序深度在1590万至2040万读段之间。在所有样本中，超过98%的读段被归类为微生物来源。人类读段占总读段的比例小于1%，其中，来自RNAlater保存样本的人类读段百分比（中位数0.56%）略高于Shield保存样本（中位数0.31%），但差异无统计学显著性 (p = 0.12)。在人类读段中，比对到miRBase数据库的比例在1.2%至4.4%之间，且两种保存方法间无差异 (p = 0.86)。
在所有8个样本中，共检测到42种成熟的人类miRNA。无监督层次聚类分析显示，样本主要按儿童供者（即独特的粪便样本）聚类，而非按保存方法聚类，这表明个体间差异对miRNA谱的影响大于保存方法的影响。此外，对这42种miRNA进行标准化的计数比较后发现，在多重检验校正后，两种保存方法之间没有任何一种miRNA的表达量存在显著差异 (pFDR≥ 0.05)。
研究列出了丰度最高的前10种miRNA，其中miR-194-5p为最丰富的miRNA。对这些前10位miRNA的高置信度预测靶基因进行基因集富集分析发现，这些靶基因在446个基因本体 (GO) 生物过程和27个PANTHER通路中显著富集。富集最显著的GO生物过程是“DNA模板转录的调控”，而最显著的PANTHER通路是表皮生长因子 (EGF) 受体信号通路。
讨论
本研究首次系统评估了婴幼儿（<2岁）粪便miRNA分析中不同保存方法和提取试剂盒的性能。研究结果确定了两种能够获得高质量RNA的方案：使用Zymo BIOMICs RNA提取试剂盒，并配合RNAlater或Zymo DNA/RNA Shield (Shield) 粪便收集管进行样本保存。这两种方案提取的RNA完整性高，且获得的miRNA谱高度相似，为未来研究提供了可靠的标准化流程。
尽管粪便中绝大多数RNA是微生物来源的，但研究仍成功从婴幼儿粪便中高置信度地鉴定出42种成熟的人类miRNA。这些miRNA，特别是丰度较高的几种（如miR-194-5p， miR-16-5p， miR-141-3p等），在肠道稳态中扮演着重要角色，涉及上皮细胞分化、增殖、上皮-间质转化、肠道屏障功能维持以及黏膜免疫调节等过程。例如，miR-16与肠易激综合征的肠道免疫系统激活和上皮屏障功能失调有关；miR-141-3p可通过调节炎症因子和氧化应激标志物来减轻坏死性小肠结肠炎的炎症反应和氧化损伤；miR-200c-3p则可通过调节紧密连接蛋白影响肠道上皮屏障功能。
本研究存在一定局限性，例如未收集粪便稠度信息，这可能影响不同方案的性能；同时，用于比较miRNA谱的样本量（n=4对）较小，可能不足以检测到特定低丰度miRNA的细微差异。尽管如此，该研究通过严谨的实验设计（随机化比较、配对样本分析、双重数据处理流程），为从婴幼儿粪便中获取高质量RNA进行miRNA研究建立了可靠的方法学基础。
结论
本研究确定了从婴幼儿粪便中获取高质量RNA用于miRNA分析的最佳方案：使用Zymo BIOMICs RNA提取试剂盒，并配合RNAlater或Zymo DNA/RNA Shield粪便收集管进行样本保存。研究证实了婴幼儿粪便中存在42种成熟的人类miRNA，其中许多在肠道稳态中具有已知的重要功能。这些发现为未来收集婴幼儿粪便样本，探索miRNA作为儿童健康的非侵入性生物标志物的潜力，提供了关键的标准化方法学依据和信息资源。
