《SCIENCE ADVANCES》：The conserved noncoding sequence CNS11 is a master control region for Rorc transcription in type 17 immune cells
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本研究旨在解析17型免疫细胞（包括TH17、ILC3s、RORγt+Treg、RORγt+γδT等）中关键转录因子RORγt的顺式调控机制。研究人员聚焦于Rorc基因座中的顺式调控元件CNS11，通过生成CNS11缺陷小鼠，系统揭示了CNS11在不同细胞类型中对RORγt表达具有启动或维持的差异化关键作用，并阐明了其通过与RORγt、RUNX3、c-MAF等转录因子结合，作为核心调控枢纽协调不同淋巴细胞RORγt表达的具体机制。该研究填补了对RORγt转录调控认知的空白，为理解相关免疫应答及自身免疫病、肠道炎症等疾病的发病机理提供了新视角。
在免疫系统的复杂网络中，有一类特殊的细胞亚群——17型免疫细胞，它们是我们抵抗病原体入侵和组织修复的重要卫士，但也与多种自身免疫病和炎症性疾病的发生息息相关。这类细胞包括辅助性T细胞17（TH17）、3型固有淋巴细胞（ILC3s）、表达RORγt的调节性T细胞（RORγt+Treg）和γδT细胞等。它们的共同“指挥官”是一个名为视黄酸受体相关孤儿受体γt（Retinoic acid receptor–related orphan receptor γt, RORγt）的转录因子。RORγt就像这些细胞的“身份标识”和功能开关，决定了它们是否能正常发育、存活并行使功能。然而，科学家们长期以来面临一个核心谜题：在基因组中，编码RORγt的Rorc基因，其自身的“开关”（即转录调控）是如何被精确控制的？虽然我们知道有一些蛋白质（反式作用因子）能调控它，但对于基因所在的DNA序列上哪些特定区域（顺式调控元件）在起关键作用，尤其是在ILC3等固有免疫细胞中，认知仍不完整。解决这个问题，对于深入理解免疫细胞分化的底层逻辑，以及开发针对相关疾病的潜在疗法至关重要。
为了解答这个谜题，研究团队将目光投向了一个名为保守非编码序列11（CNS11）的DNA区域。先前的研究提示它可能参与调控RORγt，但缺乏确凿的遗传学证据和深入的机制阐释。于是，研究人员开展了一项系统性的研究，首次通过基因编辑技术构建了CNS11完全缺失（CNS11?/?）的小鼠模型，并像侦探一样，从表型到机制，层层深入地揭示了CNS11的核心作用。他们的发现证实，CNS11是Rorc基因转录的“主控区域”，它的缺失会导致一系列惊人的后果：小鼠完全丧失了淋巴结、肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴结等次级淋巴器官（SLOs）；肠道中的ILC3s彻底消失；TH17、RORγt+Treg和RORγt+γδT细胞也无法产生。这表明，CNS11是多种17型免疫细胞正常发育和功能所不可或缺的“总开关”。这项意义重大的研究成果发表在了国际顶级期刊《SCIENCE ADVANCES》上。
为了开展这项研究，作者综合运用了多种前沿的生物技术方法。核心是使用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了CNS11条件性和全身性敲除小鼠模型，为表型分析提供了基础。在机制探索上，采用了染色质可及性测序（ATAC-seq）和切割标签测序（CUT&Tag-seq）来分析CNS11区域的开放状态及转录因子结合情况；通过DNA pull-down结合质谱技术筛选与CNS11直接相互作用的蛋白质；利用荧光素酶报告基因实验验证CNS11的增强子活性及关键转录因子结合位点的功能；通过染色体构象捕获测序（4C-seq）证实CNS11与Rorc启动子之间存在物理互作环。此外，还建立了骨髓嵌合体小鼠、向导RNA（sgRNA）介导的体内基因编辑模型、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）免疫模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型，以在体内外多维度验证CNS11的细胞自主性功能及其在免疫应答和疾病中的作用。
研究结果：研究人员通过一系列精巧的实验，逐步揭开了CNS11的神秘面纱。
CNS11是诱导RORγt表达淋巴细胞和小鼠SLO发育所必需的：分析公共数据发现，CNS11在ILC3s中染色质高度开放。CNS11?/?小鼠表现出与Rorc基因全身敲除小鼠类似的表型：完全缺失SLOs，肠道中ILC3s、TH17、RORγt+Treg和RORγt+γδT细胞全部消失，且这些细胞分泌IL-17A/IL-22的能力也严重受损。这些表型在骨髓嵌合体实验中被证实是细胞自主性的。有趣的是，CNS11杂合缺失（CNS11+/?）小鼠虽然细胞比例变化不大，但细胞内的RORγt蛋白水平已显著降低，说明CNS11以剂量依赖方式调控Rorc转录。
CNS11对TH17细胞维持至关重要，但在分化中作用有限：体外实验显示，CNS11缺失对初始CD4+T细胞向TH17分化影响很小。然而，在体内MOG免疫或EAE疾病模型中，CNS11缺失的TH17细胞在早期能正常诱导RORγt，但随后无法维持其表达，最终导致细胞功能丧失。这表明CNS11是成熟TH17细胞长期存在的“维持者”，而非“启动者”。
删除CNS11会阻断ILC3前体细胞和ILC3s的发育：在CNS11?/?小鼠的骨髓和胎肝中，共同淋巴样祖细胞（CLPs）、α4β7+淋巴样祖细胞（αLPs）等早期祖细胞正常，但向淋巴组织诱导细胞前体（LTiPs）和RORγt+的ILC祖细胞（ILCPs）的发育被完全阻断。体外培养实验也证实，来自CNS11?/?小鼠的辅助样ILC共同祖细胞（CHILPs）完全无法分化为ILC3s。在Rag1?/?CNS11?/?小鼠的DSS结肠炎模型中，疾病显著加重，且结肠ILC几乎不分泌IL-17A和IL-22。这与TH17细胞不同，说明CNS11是ILC3s发育程序启动的“必需品”。
CNS11缺陷小鼠的RORγt+抗原呈递细胞（APCs）减少：最近发现的RORγt+APCs对肠道免疫耐受至关重要。CNS11?/?小鼠脾脏中此类细胞显著减少，特别是CD127+CXCR6+MHCII+的ILC3亚群完全缺失，剩余的CD127?CXCR6?非ILC3 RORγt+APCs其RORγt和MHCII表达也大幅降低。骨髓嵌合体实验证实其发育缺陷是细胞自主性的。
CNS11通过协同机制被RORγt和RUNX3直接激活：机制探索是研究的核心。DNA pull-down实验从ILC3s核提取物中钓出了与CNS11特异性结合的蛋白，包括RUNX3和RORγt。报告基因实验证明CNS11具有增强子活性，其核心功能区（CNS11-3）内包含RUNX响应元件（RXRE）和ROR响应元件（RORE）。CUT&Tag实验证实RUNX3和RORγt确实结合在此区域。过表达实验显示，RORγt和RUNX3能协同大幅增强CNS11的活性。4C-seq实验则捕获到了CNS11与Rorc启动子之间存在的染色质环，这可能是其发挥远程调控作用的结构基础。
CNS11通过结合RORγt和RUNX3在体内调控RORγt表达和RORγt表达细胞：为了在体内验证上述结合位点的功能，研究团队设计了更精巧的实验：利用表达靶向RORE或RXRE的sgRNA的逆转录病毒，感染Cas9小鼠的骨髓细胞，然后移植入受体鼠，实现体内特异性基因编辑。结果显示，突变RORE几乎完全阻断了ILC3、TH17、RORγt+Treg和RORγt+γδT细胞的发育；而突变RXRE主要影响ILC3s，对其他细胞影响较小。这说明了RORE的普遍重要性和RXRE在ILC3s中的特异性。利用条件性基因敲除小鼠（RorcCreRunx3fl/fl和Vav1CreRunx3fl/fl），他们进一步证实RUNX3对于ILC3s中RORγt的表达和维持，以及RORγt+APCs的发育至关重要。
CNS11内的MAF识别元件对RORγt+γδT细胞和RORγt+Treg细胞的发育至关重要：除了RORE和RXRE，CNS11-3内还存在一个MAF识别元件（MARE）。类似的体内基因编辑实验表明，突变MARE会严重损害RORγt+γδT细胞和RORγt+Treg细胞的发育，但对ILC3s和TH17细胞影响甚微。在Il7rCreMaffl/fl小鼠中的验证也支持c-MAF通过此位点调控上述细胞。
研究结论与讨论：本研究系统性地揭示并证实了保守非编码序列CNS11是Rorc基因转录的主控区域。它如同一个指挥中心，通过整合不同的转录因子信号，以细胞类型特异性的方式精确调控RORγt的表达：在ILC3s等固有免疫细胞中，CNS11是发育程序启动的“钥匙”，需要与RUNX3等先锋因子协同打开Rorc表达的大门；在TH17等适应性免疫细胞中，CNS11则是长期维持细胞身份的“稳定器”，主要通过RORγt自身的正向反馈环路来巩固其表达。此外，c-MAF则通过结合CNS11上的特定位点，专门调控RORγt+γδT和Treg细胞的命运。
这项研究的重要意义在于，它首次在遗传学和机制层面完整阐述了单个顺式调控元件（CNS11）如何作为核心枢纽，协调不同转录因子（RORγt、RUNX3、c-MAF），从而差异化地调控同一关键转录因子（RORγt）在不同淋巴细胞亚群中的表达。这不仅填补了17型免疫细胞调控网络的关键空白，深化了我们对免疫细胞分化和功能可塑性的理解，也为未来针对此类细胞异常活化相关的疾病（如多发性硬化、炎症性肠病、银屑病等）提供了新的潜在治疗靶点。通过干预CNS11或其结合的特定转录因子，或许能够更精准地调节特定类型的17型免疫反应，从而在抑制病理反应的同时，保留有益的免疫保护功能。
