《SCIENCE ADVANCES》：Preclinical development of a well-defined semisynthetic glycoconjugate vaccine against Haemophilus influenzae type b
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为解决传统多糖疫苗结构异质性、生产复杂等问题，研究人员针对b型流感嗜血杆菌（Hib）开展了一项半合成糖缀合物疫苗的临床前研发。他们通过化学合成一系列结构明确的1-12聚体寡糖，筛选出四聚体（4）为关键免疫原性表位。将其与破伤风类毒素（TT）偶联制备的疫苗候选物（4-TT）在不使用佐剂的情况下，其诱导的体液与细胞免疫反应及保护效力与已上市Hib疫苗相当，为开发新一代工艺更简便、质量可控的疫苗提供了新策略。
在疫苗研发领域，b型流感嗜血杆菌（Hib）是一个令人警惕的名字。这种革兰氏阴性细菌通常寄居在人的鼻咽部，但对于婴幼儿和免疫功能低下者，它可能突破防线，引发脑膜炎、肺炎、败血症等严重甚至致命的侵袭性疾病。得益于Hib多糖结合疫苗在全球范围内的广泛应用，相关疾病的发病率已大幅下降。然而，传统的疫苗生产方式依赖于从细菌培养物中提取天然的荚膜多糖（CPS），这种多糖结构复杂、不均一，给大规模生产和严格的质量控制带来了持续挑战。此外，疫苗覆盖不均衡、Hib感染偶有爆发以及耐药菌株的出现，都呼唤着新一代更精准、更可控的疫苗技术。
问题的核心在于，我们能否像设计一把精准的钥匙一样，找到并合成出Hib细菌荚膜多糖上真正能激发有效保护性免疫反应的那个关键“锁孔”——即免疫原性表位？这正是本研究希望解答的科学问题。研究人员的目标是开发一种基于明确化学结构的半合成糖缀合物疫苗，以克服传统疫苗的缺陷。相关研究成果发表在国际知名期刊《SCIENCE ADVANCES》上。
为了达成这一目标，研究团队运用了多项关键技术。在化学合成方面，他们基于磷酸酰胺化学发展了一种模块化合成策略，高效制备了1到12个重复单元长度、结构均一的Hib荚膜多糖相关寡糖片段，这些片段带有与已上市疫苗Quimi-Hib相同的连接臂。在免疫学筛选与评价方面，他们利用糖微阵列技术对合成寡糖库进行抗原性高通量筛选；将筛选出的候选寡糖与载体蛋白（如破伤风类毒素TT）通过硫醇-马来酰亚胺点击化学进行偶联，制备糖缀合物；通过动物（新西兰兔和BALB/c小鼠）免疫实验，系统评估了糖缀合物诱导的体液免疫（酶联免疫吸附测定ELISA检测IgG/IgM及亚类、血清杀菌试验SBA）和细胞免疫反应（流式细胞术分析T细胞亚群及细胞因子）；并创新性地采用小鼠脓毒症感染模型，结合活体显微镜成像技术，直观、定量地评估了抗体介导的病原体从血液循环到肝脏库普弗细胞和肝窦内皮细胞的捕获与清除过程，从而综合评价疫苗的保护效力。
研究结果
1. 合成1-至12-聚体寡糖
研究人员成功设计并优化了一条基于磷酸酰胺方法的模块化合成路线。他们合成了关键的单体糖苷磷酸酰胺砌块13和二聚体砌块17，并优化了连接反应条件（使用N-PhIMT/TBHP体系）和脱保护条件（使用BF3·Et2O高效去除MMTr基团）。以此为基础，他们从带有连接臂的二聚体受体21出发，通过交替与单体砌块13或二聚体砌块17进行偶联延伸，最终高效合成了1-12聚体（1至12）的Hib荚膜多糖相关寡糖，为后续研究提供了结构明确的化合物库。
2. 使用糖微阵列对1-至12-聚体进行抗原性筛选
将合成的系列寡糖打印在微阵列芯片上，用抗Hib CPS或CPS-TT的免疫兔血清进行探测。结果显示，所有合成片段均能被抗体识别，其中二聚体2、四聚体4、六聚体6、十一聚体11和十二聚体12表现出较强的抗原性。二聚体2是能被识别的最小结构单元，这与前人研究一致。
3. 选定合成PRP结合物的免疫原性评价
基于微阵列结果，研究人员选择四聚体4、六聚体6、八聚体8、十一聚体11和十二聚体12与TT蛋白偶联，制备成糖缀合物，并免疫新西兰兔。ELISA结果显示，所有糖缀合物均能诱导特异性的体液免疫反应，其中4-TT诱导的IgG抗体水平最高，甚至显著高于已上市的Hib疫苗（MINHAI Hib）阳性对照组。流式细胞术和血清杀菌试验进一步证实，4-TT免疫血清对Hib细菌的结合亲和力与杀菌活性最强。糖微阵列分析还发现，针对已上市疫苗的抗体与四聚体4的结合力最强，提示四聚体是关键的免疫原性表位。
4. 载体蛋白、剂量和佐剂对糖缀合物4-TT免疫原性的影响
研究人员进一步优化疫苗配方。在载体蛋白选择上，比较了TT和CRM197，发现4-TT诱导的免疫反应更强。在佐剂和剂量方面，发现添加铝佐剂（Alum）的4-TT能更快、更强地激发抗体反应；然而，不使用任何佐剂的4-TT（无论5μg还是20μg糖剂量）所诱导的免疫反应水平与已上市疫苗相当，表明其在不依赖佐剂的情况下即可达到平台效应。这为开发无佐剂疫苗配方提供了可能。
5. 评价4-TT糖缀合物在小鼠中诱导的特异性体液和细胞免疫反应
在BALB/c小鼠模型中评估4-TT的免疫特性。结果显示，无佐剂的4-TT能诱导与已上市疫苗水平相当的特异性IgG、IgM及其各亚类（IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3）抗体，表明其能有效引发抗体的类别转换。流式细胞术分析显示，4-TT能显著激活脾脏中的CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞，并能促进CD4+T细胞在病原体刺激下产生干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4），诱导了混合的TH1和TH2型免疫应答。这证明4-TT能有效激发与已上市疫苗类似的体液和细胞免疫反应。
6. 在小鼠脓毒症感染模型中评估4-TT糖缀合物的保护效力
通过一个创新性的疫苗评价系统，研究人员在活体层面直观研究了4-TT免疫血清的保护机制。将Hib细菌与不同免疫血清预孵育后静脉注入小鼠，发现4-TT、4-TT+Alum及已上市疫苗的免疫血清均能高效、快速地将血液中的细菌清除，并主要捕获至肝脏。活体显微镜成像进一步揭示，这些高效价血清能显著促进肝脏窦腔中的库普弗细胞和肝窦内皮细胞对循环细菌的捕获，而无佐剂的4-TT血清在此方面的效力与已上市疫苗血清无显著差异。这从机理上证实了4-TT糖缀合物具有强大的体内保护效能。
研究结论与意义
本研究通过系统的化学合成与免疫学评价，成功从Hib荚膜多糖的1-12聚体库中筛选出四聚体（4）为关键的免疫原性表位。将其与破伤风类毒素（TT）偶联制备的无佐剂糖缀合物疫苗候选物4-TT，在临床前研究中展现出卓越的性能：它能诱导与已上市多糖疫苗效力相当的、强大的体液与细胞免疫反应；其免疫血清具有高结合活性和血清杀菌能力；更重要的是，在模拟人体清除病原体机制的小鼠脓毒症感染模型中，4-TT免疫血清能高效介导肝脏免疫细胞捕获并清除血液循环中的细菌，其保护效力与已上市疫苗相当。
这项研究的意义重大。首先，它明确了Hib疫苗的最小高效免疫表位，为基于理性设计的下一代疫苗开发提供了精确的分子蓝图。其次，它验证了基于磷酸酰胺化学的模块化合成策略可用于大规模生产结构明确的糖类抗原，解决了传统多糖疫苗生产中的异质性问题，使生产工艺更简化、质量更可控。最后，研究结果表明，这种无佐剂的、结构明确的半合成糖缀合物疫苗在临床前研究中达到了与现有疫苗非劣效的效果，为推进其进入临床试验奠定了坚实的科学基础，有望为全球，特别是疫苗生产和质量控制面临挑战的地区，提供一种更优的Hib疾病预防选择。
