《Analytica Chimica Acta》：Label-free and isothermal multiplex detection of miRNAs using self-priming hairpin probes and light-up aptamer transcription
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一种基于自引发发夹探针和荧光自发光aptamer（FLAPs）的等温多плексmiRNA检测系统，实现了对miR-21、miR-141和let-7d的低皮摩尔级灵敏检测，通过不同FLAP-荧光团对减少光谱干扰，无需荧光标记探针，简化多plex检测流程。
Hyogu Han | Hyo Won Jeon | Jieun Yang | Chang Yeol Lee | Jun Ki Ahn
韩国仁川市加川大学生物系，邮编21936
摘要
背景
微小RNA（miRNA）是基因表达的关键转录后调节因子，可作为多种疾病（包括癌症）早期诊断和预后的重要生物标志物。然而，传统的miRNA检测方法通常涉及复杂的探针设计、多步骤反应以及有限的多重检测能力。
结果
在本研究中，我们开发了一种无标记、等温的多重miRNA检测系统，该系统结合了自启动发夹探针和荧光激活适配体（FLAPs）的转录技术。每个发夹探针编码一个针对特定miRNA的FLAP序列，在识别目标miRNA后，通过T7 RNA聚合酶介导的转录过程产生荧光信号。该方法能够灵敏且选择性地检测三种目标miRNA（miR-21、miR-141和let-7d），检测限可低至皮摩尔级别。通过使用FLAP-荧光团对，实现了高效的多重检测，同时减少了光谱干扰。
意义
所开发的方法使用细胞来源的RNA提取物，在癌细胞系和正常细胞系中重现了预期的miR-21差异表达模式，结果与干细胞环RT-qPCR结果一致。值得注意的是，该方法每个目标miRNA仅需要一个发夹探针，并且采用无标记格式进行检测，从而简化了多重检测过程，减少了相互干扰。这一平台为生物分析和诊断领域中的高效miRNA分析提供了实用途径。
引言
微小RNA（miRNA）是长度通常在18到25个核苷酸之间的单链RNA分子，在基因表达的转录后调控中起着关键作用。miRNA存在于各种真核生物中（包括植物和动物），通过与互补的信使RNA（mRNA）结合来调节多种生物过程，从而实现基因沉默[1]、[2]、[3]。由于其调控功能，miRNA在人类疾病中的关键作用日益受到重视。过去二十年的研究表明，miRNA表达的失调常与多种疾病相关，尤其是癌症和心血管疾病[4]、[5]。血液和细胞样本中miRNA的异常表达模式表明它们作为疾病诊断和预后的有前景的生物标志物具有巨大潜力[1]、[4]、[5]。在乳腺癌中，几种miRNA表现出差异表达模式；特定miRNA（如miRNA-21、miRNA-10b、miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-155和miRNA-191）表达上调，而其他miRNA（如miRNA-7、miRNA-17p、miRNA-27b、miRNA-143和miRNA-139）表达下调[6]、[7]。其中，miRNA-21与乳腺癌的关联尤为密切，这突显了其作为癌症诊断和预后重要生物标志物的潜力[7]、[8]。
目前，干细胞环逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）被认为是miRNA检测的金标准[9]。尽管这种方法对目标miRNA具有高灵敏度和特异性，但也存在一些局限性，例如需要热循环仪进行扩增、由于多个引物和探针之间的交叉杂交而限制了多重检测能力，以及使用荧光团/淬灭剂标记的TaqMan或分子信标探针的成本较高。为了解决这些问题，人们开发了多种先进的检测策略，如电化学发光（ECL）[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、荧光测定[18]、[19]、[20]、[21]、[22]和比色法[23]、[24]、[25]、[26]等技术，这些方法虽然灵敏度高，但仍需要复杂的预反应步骤、复杂的探针修饰以及需要与每个目标特异性结合的多探针设计。
荧光激活适配体（FLAPs）是一种特殊的RNA序列，能够特异性结合荧光团，在结合时激活荧光[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。这些荧光团在未结合时几乎不发光，但与FLAPs结合后会产生强荧光，使其在生物传感应用中非常有效。这一独特性质促进了利用FLAPs作为信号组分的生物传感器的开发，实现了多种分析物的灵敏检测[19]、[20]、[32]、[33]、[34]、[35]。此外，基于FLAP的适配体传感器通过使用多个FLAP-荧光团对实现多重检测，覆盖整个可见光谱范围，从而无需使用传统的双标记探针[19]、[34]、[36]、[37]、[38]。
在本研究中，我们旨在通过将FLAPs与针对每个目标miRNA的独特自启动发夹探针结合，建立一种新的多重miRNA检测方法。利用这种方法，我们同时以高灵敏度和特异性检测了三种目标miRNA（miR-21、miR-141和let-7d），并且成功测定了不同癌细胞系中的miRNA含量，其结果与标准干细胞环RT-qPCR的结果高度一致。该方法克服了传统检测方法的局限性，无需复杂的探针设计，同时提供了一个适用于检测多种miRNA的通用平台。
材料
本研究中使用的所有DNA序列（表S1）和无核酸酶的水均购自Integrated DNA Technology Inc.（美国爱荷华州科拉尔维尔）。10× T7 RNA聚合酶缓冲液、T7 RNA聚合酶、RNase抑制剂和DNA聚合酶I（Klenow片段，exo-）购自Enzynomics（韩国大田）。NTP、dNTP Mix和10000× SYBR Gold核酸凝胶染色剂购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。HBC620购自GlpBio Technology（美国加利福尼亚州蒙特克莱尔）。
miRNA检测系统的总体原理
如图1所示，所开发的方法基于目标miRNA与单个发夹探针之间的相互作用。目标miRNA与发夹探针的环区互补杂交，逐渐解旋至茎区。结合后，目标miRNA暴露出茎区内的自启动区域，该区域随后与3′端的趾部序列杂交，从而启动Klenow片段的DNA聚合反应。
结论
总之，我们开发了一种基于自启动发夹探针的多重miRNA检测方法，这些探针编码由T7 RNA聚合酶转录的荧光激活适配体（FLAPs）。该策略在等温条件下实现灵敏且选择性的检测，通过FLAP-荧光团对实现多重检测，且光谱干扰最小。由于探针无标记，无需荧光团或淬灭剂修饰，因此检测设计更加简洁。
CRediT作者贡献声明
Jun Ki Ahn：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取。
Hyogu Han：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。
Jieun Yang：验证、方法学设计、数据分析。
Hyo Won Jeon：验证、方法学设计、数据分析。
Chang Yeol Lee：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了韩国贸易、工业和能源部（MOTIE）资助的“技术创新计划”（开发用于超灵敏和快速多重诊断呼吸道感染的完全集成电化学微流控系统，项目编号RS-2024-00400234）的支持。
