《Analytica Chimica Acta》：“IEDDA”-activated Fluorescent Sensing for Protein Cysteine Redox Modifications Profiling
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背景：蛋白质半胱氨酸氧化修饰（如硫醇和硫羧酸）在氧化应激和疾病中起关键作用，但现有荧光探针存在背景高、动态追踪能力不足的问题。目的：开发背景消除的“开-关”荧光探针系统。方法：设计BCN-SH和BCN-SOH探针，利用逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应与BODIPY-tetrazine结合，实现硫醇/硫羧酸的特异性检测。结果：探针在活细胞和线虫中实现高灵敏度、低背景的实时动态追踪，荧光强度提升248倍。意义：为氧化生物学研究提供新型工具，突破传统“常亮”探针的局限。
陈林峰|郑一夫|王紫怡|王天阳|文欣|王慧玲|刘春荣
国家绿色农药重点实验室，华中师范大学化学学院，智能生物传感技术与健康国际联合研究中心，中国武汉，430079
摘要
背景
蛋白质半胱氨酸的磺酰化是一种在氧化还原信号传导和疾病病理学中起关键作用的可逆修饰。然而，全面监测这些事件仍然具有挑战性，因为大多数现有的“始终开启”荧光探针存在高背景信号的问题，并且缺乏在活体系统中进行动态、实时跟踪的能力。
结果
在这里，我们开发了一种基于逆电子需求Diels–Alder（IEDDA）反应的无背景“开启”传感策略。我们设计了选择性探针BCN-SH和BCN-SOH，分别用于标记蛋白质巯基和磺酸，通过引入一个双环[6.1.0]壬-4-炔（BCN）结构来实现这一目标。随后与基于四嗪的荧光团BODIPY-tetrazine（BTZ）的反应可引发248倍的荧光增强，从而实现高对比度检测。这些探针表现出优异的选择性和稳定性，成功地在氧化应激下的活体HeLa细胞中可视化了内源性半胱氨酸的氧化还原动态。此外，我们将这一策略扩展到了秀丽隐杆线虫中的荧光成像。
意义
将选择性的半胱氨酸化学与荧光生物正交激活相结合，该平台实现了无背景、时间分辨的动态氧化还原事件的可视化。这一策略扩展了氧化还原生物学的化学工具箱，有助于对氧化信号传导的机制进行研究。
引言
活性氧（ROS）作为重要的信号分子和细胞代谢的副产物，通过氧化修饰在调节蛋白质功能中发挥关键作用[1]。因此，基于氧化还原的蛋白质修饰（PTMs）已成为细胞在不同生理条件下调节蛋白质活性和维持信号传导的重要机制。半胱氨酸残基具有亲核性的巯基侧链，特别容易受到氧化还原修饰的影响，这种修饰通过改变各种氧化状态来调节蛋白质的结构和活性。这些氧化还原修饰通常是可逆的，使蛋白质能够动态响应细胞环境的变化，尤其是在氧化应激条件下[2]，因此在细胞信号传导[3]、调节[4]和疾病发病机制[5]、[6]中起着关键作用。鉴于半胱氨酸的生物学重要性，过去几十年中开发出了大量的化学方法和荧光探针，用于选择性地检测和监测生物系统中的游离半胱氨酸巯基[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。同时，这些化学基础促进了先进的定量蛋白质组学的快速发展，使得能够对整个蛋白质组的半胱氨酸反应性和氧化还原状态进行 profiling[12]、[13]、[14]。
在半胱氨酸的各种氧化状态中，磺酸（Cys-SOH）占据了一个独特的中间体位置[15]、[16]。当暴露于ROS时，半胱氨酸巯基容易被氧化成磺酸，后者作为进一步氧化还原转化的分支点。根据局部环境和细胞氧化还原平衡的不同，Cys-SOH可以转化为二硫化物、磺酰胺或亚砜衍生物[17]、[18]。与更高的氧化状态（如磺酸）不同，磺酸通常是可逆的，因此它充当了一个动态的分子开关，将氧化还原信号传导与蛋白质调节整合在一起[19]、[20]。这种短暂且反应性的特性使其在依赖于快速和可逆巯基氧化的途径中发挥关键生物学作用。
鉴于蛋白质磺酰化的生物学重要性，人们投入了大量努力来开发用于其检测的化学工具[21]。Allison的早期研究表明，dimedone可以用来选择性地捕获蛋白质磺酸[22]。Furdui及其同事进一步引入了基于1,3-环戊二酮的探针，这些探针对磺酸的选择性得到了增强[23]、[24]。Carroll及其同事随后对碳中心亲核试剂的结构-反应性关系进行了系统研究，并开发了一系列磺酸探针，包括DAz-1 [20]、[25]、DAz-2 [26]和BTD [23]，这些探针在生理条件下对磺酸的选择性和反应性得到了进一步改进。此外，Poole小组和Benkovic小组分别报道了7-氯-4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑（NBD-Cl）和芳基硼酸衍生物作为标记蛋白质磺酸的探针[27]、[28]。最近，新一代探针如WYneN被开发出来，以进一步提高在复杂生物环境中的标记效率和动力学特性[29]。这些探针为半胱氨酸氧化还原生物学提供了宝贵的见解，使得能够在蛋白质组水平上研究蛋白质磺酰化，并有助于表征氧化还原调控的信号通路[30]、[31]、[32]。同时，荧光团共轭探针能够直接可视化活体细胞中的磺酸动态，实现具有空间和时间分辨率的氧化还原变化的实时监测[25]、[26]、[33]。然而，大多数报道的荧光磺酸探针依赖于“始终开启”的荧光团设计，这会导致高背景信号，并限制了定量或动态研究的适用性。为了克服这些限制，需要新的化学策略，将高选择性与报告动态氧化还原变化的能力结合起来。
Weissleder及其同事首次发现四嗪基团可以暂时抑制荧光团的发射，这种抑制可以通过与TCO的逆电子需求Diels–Alder（IEDDA）反应来恢复[34]。基于这一概念，Devaraj小组和Wu小组随后开展了一系列研究，扩展了基于四嗪的荧光探针的应用范围[35]、[36]、[37]、[38]、[39]（图1A）。受此方法的启发，我们将高度选择性的半胱氨酸和亚砜共轭化学与IEDDA触发的荧光“开启”策略相结合，开发了一种能够在活细胞中成像蛋白质半胱氨酸氧化修饰的“IEDDA”激活协议（图1B）。这些探针在水介质中表现出优异的选择性、快速的动力学和高稳定性，能够分别高效地标记蛋白质、细胞和生物体水平的巯基和亚砜。值得注意的是，我们观察到荧光强度的变化与活细胞中的氧化刺激密切相关，从而实现了对细胞内蛋白质半胱氨酸残基氧化还原变化的实时监测。总体而言，这项研究不仅扩展了基于荧光的化学探针的种类，还为研究氧化应激和ROS信号传导中半胱氨酸氧化修饰的动态作用提供了一个强大的平台。与传统的“始终开启”探针不同，这种IEDDA激活策略通过其选择性的荧光开启机制显著降低了背景信号，从而确保了高对比度的成像分辨率。
材料与通用实验方法
所有化学试剂均从商业供应商处购买，包括中国医药化学试剂有限公司和Aladdin试剂有限公司，使用前无需进一步纯化。荧光光谱是在荧光分光光度计（Agilent Cary Eclipse）上记录的。凝胶荧光成像使用FluorChem R化学发光成像系统（ProteinSimple）进行。图像分析是在激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP5X）上完成的。HPLC分析则
“IEDDA”激活荧光探针的设计与合成
如上所述，我们的标记策略包括将四嗪基团连接到荧光团以抑制其荧光，将一个张力的二烯ophile连接到能够选择性识别半胱氨酸巯基或磺酸的化学探针上，并通过EDG与四嗪的“IEDDA”反应来触发荧光响应。在Wu及其同事之前的工作中，将四嗪基团连接到基于BODIPY的荧光团（BTZ）上会暂时抑制其荧光，然后通过
结论
总之，我们开发了一种“IEDDA”激活的荧光标记平台，用于检测蛋白质半胱氨酸巯基和磺酸，通过将BCN作为BTZ的稳定激活剂与两种选择性探针BCN-SH和BCN-SOH结合来实现。这些探针在生理条件下表现出高稳定性、反应性和选择性。它们的性能在体外模型蛋白和细胞裂解物中得到了验证，并扩展到了活细胞成像，并进一步应用于模型生物C. elegans中，
CRediT作者贡献声明
刘春荣：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、方法学、资金获取、数据管理、概念化。王紫怡：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验。王天阳：撰写 – 审稿与编辑、验证。文欣：撰写 – 审稿与编辑、验证。王慧玲：撰写 – 审稿与编辑、验证。郑一夫：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、方法学、实验。陈林峰：撰写 – 原始草稿，
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了NSFC（22077045）的支持。
