《Animal Reproduction Science》：Ovarian storage time and semen source do not affect IVF outcome in domestic cats (
Felis catus), but reproductive season does
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猫卵体外成熟及受精研究显示，4℃下卵巢存储≤30小时不影响卵子成熟与受精潜力，繁殖季节（2-4月）显著提升IVM和IVF成功率，而精液类型中新鲜epididymal精子胚胎发育率最高，但冷冻精子无显著差异。
Natalia Sowinska|Malgorzata Ochota|Agnieszka Partyka|Katarina Jewgenow|Wojciech Nizanski
波兰波兹南生命科学大学（PULS）兽医医学与动物科学学院内科疾病与诊断系，地址：Szydlowska 50，波兹南 60-637
摘要
家猫（Felis catus）为开发辅助生殖技术（ART）提供了宝贵的模型，这些技术可应用于濒危野生猫科动物的保护。辅助生殖技术应用的主要限制在于高质量配子的获取和运输难度较大。本研究探讨了卵巢储存时间、精液来源及季节对家猫体外成熟（IVM）、受精（IVF）和胚胎发育的影响。实验中，从常规卵巢子宫切除术中获取的卵巢在4°C下储存：短期储存时间为≤10小时，长期储存时间为11–30小时。使用附睾精液、尿道精液或冷冻保存的附睾精液对卵子进行受精处理，共评估了666个卵子。多变量回归分析显示，储存时间对卵子成熟或后续胚胎发育没有显著影响。相反，季节是影响IVM和IVF结果的主要因素，在繁殖季节（2月至4月）采集的卵子成熟和胚胎形成的概率显著高于非繁殖季节（12月至1月）。精液类型对IVF后的胚胎形成有显著影响，使用附睾精液时胚胎形成率更高，而冷冻保存的精液则没有显著效果。结果表明，家猫卵子在4°C下储存30小时内仍保持减数分裂和发育能力，但季节因素对生殖结果影响最大，精液来源可能影响体外条件下的早期胚胎发育。
引言
由于栖息地丧失、气候变化以及人类活动范围扩大，野生猫科动物正面临全球性数量下降，许多物种已濒临灭绝或处于脆弱状态。小型和中型猫科动物大多缺乏可行的异地种群，因此面临更大的灭绝风险。在这种情况下，辅助生殖技术（ART），如体外受精（IVF），通过保护遗传多样性和促进野生种群与圈养种群之间的基因流动，为保护工作提供了有力工具。尽管ART对物种保护的总体贡献尚有限，但其战略应用（尤其是与栖息地保护结合使用时）越来越受到重视。家猫（Felis catus）因其相似的生殖生理特性，成为开发和完善野生猫科动物辅助生殖技术方案的有效模型物种（Swanson, 2023）。
辅助生殖技术中的一个关键后勤挑战是将生物材料（尤其是卵巢）从野外采集地运输到专业实验室。在许多情况下，需要将样本在低温（4°C）下储存，尤其是对于死后采集或在偏远地区采集的样本。然而，长时间储存（尤其是超过10小时）对卵子质量和发育能力的影响尚不明确。现有研究表明，长时间储存（例如48小时）会导致卵子质量下降（Evecen等人，2009年；Ochota等人，2023年），这凸显了阐明储存时间对卵子存活率及其对ART结果影响的必要性。
在猫科动物中，获取雄性配子及精液采集方法也存在实际和伦理挑战。虽然电刺激射精在某些情况下被使用，但需要麻醉并引发福利问题，且结果往往不稳定。附睾精液采集方法有效，但属于一次性操作，不适合对具有遗传价值的个体进行重复采集。相比之下，尿道导管插入法是一种有前景的微创替代方法（Prochowska等人，2015年）。该方法仅需镇静，能够获取适合ART应用的高质量精液，对供体的影响最小（Prochowska和Nizański，2017年；Swanson等人，2017年；Zambelli等人，2008年）。
除了采集方法外，冷冻保存精液的使用是生殖生物技术的一项重要进展。冷冻保存配子的能力为IVF程序提供了时间和地理上的灵活性。然而，该领域的主要挑战在于对配子来源和质量的了解有限，通常缺乏关于供体品种、年龄、健康状况、雌性生殖周期阶段以及储存条件（如温度和卵巢储存时间）的信息。这些因素都可能影响配子和胚胎的发育能力。通过计算机辅助精子分析（CASA）和流式细胞术进行的比较研究评估了新鲜（附睾精液 vs. 尿道精液）和冷冻精液的效果（Prochowska等人，2016年；Prochowska等人，2015年），但仅有少数研究评估了不同精液来源在IVF中的胚胎结果（Filliers等人，2010年；Prochowska和Nizański，2017年）。为填补这些空白，本研究探讨了卵巢储存时间和精液来源对家猫卵子体外成熟（IVM）和IVF成功率的综合影响。样本采集既包括繁殖季节也包括非繁殖季节，储存时间分为≤10小时和11–30小时两类。研究使用了新鲜精液（附睾精液和尿道精液）以及冷冻保存的附睾精液。通过分析这些变量的相互作用，本研究旨在改进ART方案，并促进其在家猫和濒危猫科动物保护中的应用。
材料与方法
除非另有说明，所有化学品均从Sigma-Aldrich购买。
结果
多变量逻辑回归分析显示，季节对体外卵子成熟有显著影响。繁殖季节采集的卵子成熟概率显著高于非繁殖季节（OR = 1.88，95% CI: 1.38–2.57，P = 0.020）（表1）。储存时间对IVM结果无显著影响（OR = 1.20，95% CI: 0.88–1.64，P = 0.491）（表2）。
IVF后胚胎发育分析表明季节具有显著影响。
讨论
我们的研究发现，将家猫卵巢在4°C下储存长达30小时不会对卵子成熟或受精结果产生负面影响。这与早期研究结果一致，即短期低温储存能够保持减数分裂能力。Evecen等人（2009年）报告称，储存2至24小时内卵子成熟率没有显著下降，但储存48小时后出现显著下降，表明存在一个临界阈值，超过该阈值细胞损伤会累积。Naoi等人（2007年）也有类似发现。
结论
总之，本研究表明，在4°C下储存卵巢长达30小时不会影响卵子质量、减数分裂能力或受精潜力，从而为家猫和野生猫科动物的辅助生殖技术应用提供了必要的灵活性。此外，不同精液来源（附睾精液或尿道精液）在IVF结果上没有显著差异，这证明了这两种精液类型在常规和保护性繁殖应用中的通用性。
作者贡献声明
Wojciech Nizanski：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。Katarina Jewgenow：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。Agnieszka Partyka：撰写、审稿与编辑、数据分析、数据管理。Ochota Malgorzata：撰写、审稿与编辑、资源协调、实验设计。Natalia Sowinska：初稿撰写、资源协调、项目管理、方法设计、数据管理、概念构思。
致谢
本研究的开展得到了领先研究小组的支持，该支持项目属于2018年7月20日波兰科学与高等教育部法案中的第387（3）条，2020–2025年期间的补贴金额增加了2%。作者感谢M. Sc. Barbara Smalec提供的技术支持，以及Marcin Ryszek在统计分析方面提供的宝贵建议和帮助。
