《Animal Reproduction Science》：Effect of RGFP966 application in key steps of sheep somatic cell nuclear transfer on cloned embryo development
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HDAC3特异性抑制剂RGFP966通过促进受体卵母细胞成熟（63.0%±4.6% PB1外排率）、优化胚胎表观遗传重编程（H3K27ac↑/H3K9me3↓）及滋养层发育（CDX2↑），显著提高羊体细胞核移植胚胎的分裂率（95.6% vs 85.7%）和囊胚形成效率，但增加 morula凋亡（P<0.01）。
宋红远|齐志鹏|何俊丽|严玉洁|王静华|闵思瑞|陈强|刘新峰
教育部西部特殊生物资源保护与利用重点实验室，宁夏大学，中国银川750021
摘要
本研究探讨了组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）选择性抑制剂（E）-N-(2-氨基-4-氟苯基)-3-(1-肉桂基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺（RGFP966）在优化绵羊体细胞核移植（SCNT）关键步骤中的作用和机制。使用“18h + 4h”两步卵母细胞成熟方案，16μM的RGFP966将第一极体（PB1）的排出率显著提高至63.0% ± 4.6%（对照组为51.7% ± 4.5%，P < 0.05）。鉴于HDAC3在8细胞和16细胞阶段的高表达水平（P < 0.05），RGFP966在SCNT的关键步骤中联合使用：16μM用于受体卵母细胞成熟，10μM用于供体细胞预处理，16μM用于1细胞重构胚胎培养。结果表明，这种联合处理显著提高了克隆胚胎的裂变率（95.6% ± 0.7% vs 85.7% ± 0.4%，P < 0.05），增强了囊胚的表观遗传重编程（H3K27ac增加，H3K9me3减少，P < 0.05），并促进了滋养层发育（CDX2增加，P < 0.05）。然而，它对胚泡率没有显著影响，而处理组的胚泡凋亡水平显著升高（P < 0.01）。总之，RGFP966的联合处理通过促进卵母细胞成熟、改善重编程和增强滋养层功能来优化绵羊克隆胚胎的早期发育，但RGFP966诱导的胚泡凋亡限制了囊胚率的提高。本研究为通过靶向HDAC3调控优化SCNT提供了理论基础。
引言
SCNT是动物生殖生物学领域的核心技术。它在优良家畜的繁殖、濒危物种的保护以及生物医学模型的构建中发挥着不可替代的作用（Cordova等人，2017年）。然而，该技术仍面临克隆胚胎发育停滞、囊胚率低和出生后异常等问题（Loi等人，2016年；Xu等人，2023年；Yang等人，2020年）。研究表明，异常的表观遗传重编程是克隆胚胎发育缺陷的关键原因，其中组蛋白修饰的动态调节失衡尤为突出（Burton和Torres-Padilla，2025年；Li等人，2023年；Matoba等人，2014年；Xu等人，2023年）。
组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）是表观遗传调控的关键分子，通过催化组蛋白去乙酰化维持染色质的浓缩状态，并参与基因表达的沉默（Bhaskara等人，2008年；Kotwal和Amere Subbarao，2020年；Paluvai等人，2023年；Zhao等人，2023年）。在SCNT过程中，供体细胞的表观遗传记忆难以有效清除。HDAC3的异常高表达可能会加剧染色质重塑缺陷，导致胚胎基因组激活（EGA）受阻和发育潜力下降（Kim等人，2019年；Matoba等人，2014年；Qi等人，2008年）。先前的研究表明，RGFP966作为HDAC3的特异性抑制剂，通过抑制HDAC3活性来提高染色质的可及性，并在小鼠和猪的早期胚胎发育中显示出促进重编程的潜力（Huang等人，2024年；Jeong等人，2021年；Jin等人，2017a年；Matoba等人，2014年；Zhang等人，2021年）。
作为重要的经济动物和生物医学模型，绵羊SCNT的效率仍有待提高。在猪的研究中，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂（包括非特异性或选择性抑制剂）可以通过调节组蛋白修饰（例如，增加组蛋白乙酰化水平）有效提高克隆胚胎的囊胚质量和发育潜力（Jeong等人，2021年；Jin等人，2014年；Jin等人，2017b年；Li等人，2008a年；Song等人，2014年）。在绵羊SCNT研究中，HDAC活性与胚胎基因组激活（EGA）的停滞密切相关，广谱HDAC抑制剂Scriptaid可以显著提高绵羊克隆胚胎的囊胚率（Fang等人，2020年；Wen等人，2014年）。然而，RGFP966作为HDAC3的特异性抑制剂在绵羊SCNT中的应用尚未进行系统研究。基于此，本研究重点关注SCNT的关键步骤（受体卵母细胞成熟、体细胞预处理和胚胎发育阶段的调控），系统探讨了RGFP966对绵羊克隆胚胎的发育潜力、表观遗传重编程和细胞凋亡的影响。目的是明确HDAC3抑制在提高绵羊SCNT效率中的作用和机制，从而为优化克隆技术系统提供理论基础和实际参考。
章节摘录
卵巢采集
卵巢样本来自宁夏回族自治区银川市永宁县鸿祥牛肉羊肉屠宰场。新鲜卵巢置于预先加热至37°C的生理盐水中（添加青霉素-链霉素），然后装入1.5L保温真空瓶中，并在2-4小时内运回实验室。
试剂和材料
RGFP966（纯度≥98%，CAS 1391732-10-0；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）；体外成熟培养基（BO-IVM；IVF Bioscience，英国法尔茅斯）；
RGFP966对SCNT中受体卵母细胞体外成熟的影响
对照组和16μM RGFP966处理组的PB1排出率分别为（51.7 ± 4.5%）和（63.0 ± 4.6%）；处理组使排出率显著提高了约12%（P < 0.05，表1，图1）。结果表明，RGFP966可以有效促进绵羊卵母细胞的体外成熟，并在后续的SCNT程序中用于受体卵母细胞的体外成熟。
探索RGFP966在SCNT衍生克隆胚胎发育阶段的应用
结果表明...
讨论
本研究系统探讨了RGFP966作为HDAC3特异性抑制剂在绵羊SCNT关键步骤中的应用效果。研究发现，RGFP966可以通过促进卵母细胞成熟、改善表观遗传重编程和滋养层（TE）发育来显著影响克隆胚胎的发育特性，同时揭示了其在胚泡凋亡中的潜在调控作用。
卵母细胞成熟的质量是SCNT成功的基础，而同步...
结论与未来展望
总之，在卵母细胞成熟、体细胞预处理和1细胞重构胚胎培养过程中联合使用RGFP966显著提高了克隆胚胎的裂变率，改善了EGA阶段的表观遗传调控，并增强了囊胚重编程效率（H3K27ac上调和H3K9me3下调）以及滋养层发育（CDX2上调）。然而，胚泡阶段的凋亡增加限制了...
CRediT作者贡献声明
宋红远：撰写——原始草案，可视化，验证，监督，软件使用，资源提供，项目管理，方法学设计，研究实施，资金获取，数据分析，概念化。严玉洁：可视化，验证，软件使用，资源提供，研究实施，数据分析。何俊丽：可视化，验证，软件使用，资源提供，研究实施，数据分析。齐志鹏：撰写——原始草案，可视化，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号32160791）；宁夏自然科学基金重点项目（项目编号2024AAC02019）；以及宁夏回族自治区重点研发计划（人才引进专项）（项目编号2024BEH04111）的支持。所有作者均阅读并批准了最终稿件。
