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这项研究通过宏基因组测序技术，系统地揭示了意大利托斯卡纳中部-南部地区白纹伊蚊(Aedes albopictus)、尖音库蚊(Culex pipiens)及白蛉亚科昆虫携带的病毒组(viral community)多样性。作为该地区首份针对此类虫媒媒介的全面病毒组研究，它不仅鉴定了超过30个病毒科的广泛病毒群落，并首次在意大利发现了可能具有人兽共患潜力的蓬尼病毒(PUNV)。本研究为深入了解虫媒病毒的生态、传播动力学及病毒监视提供了关键的基础数据，突显了在气候变化和全球化背景下加强节肢动物媒介病原体监控的必要性。
引言
蚊虫（双翅目：蚊科）是众所周知的病毒病原体媒介，传播着影响全球数百万人的疾病。以白纹伊蚊、按蚊和库蚊属蚊虫叮咬为主要传播途径的节肢动物传播病毒(arbovirus)构成了重大的全球公共卫生威胁，其分布受生态、气候和社会经济多种因素影响。城市化、全球化和气候变化导致蚊属向先前不存在的地区扩散，虫媒病毒爆发在全球范围内逐年增加。大多数已知的虫媒病毒属于RNA病毒，其遗传多样性高于DNA病毒，这归因于病毒RNA依赖性RNA聚合酶易于出错且缺乏校对活性。长时期的节肢动物-病毒协同进化塑造了它们之间复杂的相互作用。此外，蚊虫还感染多种宿主范围受限的病毒，称为昆虫特异性病毒，它们不感染脊椎动物，但在其宿主中与持续性和无症状感染相关，近年来因其在调节蚊虫生物学和影响致病性虫媒病毒传播方面的潜在作用而备受关注。本研究的目的是利用宏基因组学方法，分析意大利托斯卡纳中部-南部锡耶纳和格罗塞托地区尖音库蚊、白纹伊蚊以及蛾蚋科白蛉亚科物种的病毒组。
材料与方法
样本采集与鉴定
在2022年至2024年期间的春季至初秋季节（5月至10月），使用诱蚊灯在意大利托斯卡纳的锡耶纳和格罗塞托地区的各个城乡地点采集样本，总共采集了3，732只蚊子和沙蝇。同时，也使用产卵诱捕器作为采样方法。成蚊通过形态学检查进行分选和鉴定，主要依据相关分类学指南在锡耶纳大学的进化动物学和系统学实验室完成。蚊虫样本根据采集日期、性别和物种等信息进行合并，形成最多50只个体的批次池。随后进行机械匀浆和离心，取上清用于核酸提取。
核酸检测与反转录
使用试剂盒从每个蚊虫或沙蝇池匀浆液等分样品中提取总RNA，并通过独特去除柱去除宿主基因组DNA。使用一步法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒，采用针对布尼亚病毒目白蛉病毒属病毒RNA依赖性RNA聚合酶基因的泛引物、针对白蛉病毒属核蛋白基因的引物以及针对黄病毒属RNA依赖性RNA聚合酶基因的泛黄病毒引物进行RT-PCR检测，并通过琼脂糖凝胶电泳分析预期大小的扩增产物。
样本测序
选择通过RT-PCR检测对一种或两种病毒靶标呈阳性的样本进行宏基因组分析。使用专门的文库制备试剂盒进行cDNA合成和文库构建。最终文库在MiSeq平台上进行双末端测序。
序列组装与分析
FASTQ文件使用开源CzID平台进行分析。首先对低复杂度、低质量碱基和短读长进行过滤。随后使用DIAMOND比对工具比对NCBI非冗余数据库以获取病毒序列，并应用特定的过滤参数。在报告阶段，仅考虑那些在NT和NR比对中均得到支持且满足比对长度和每百万读长阈值要求的分类单元，以减少假阳性和过度分类。生成的注释FASTA文件进一步使用SPAdes软件进行组装，得到的读长使用BLAST进行比对，并生成新的注释FASTA文件。
系统发育分析
选择覆盖率不低于30%且最常识别的共有序列，使用Geneious软件进行多序列比对。通过MUSCLE算法进行比对，然后使用邻接法和Jukes-Cantor距离模型生成系统发育树，并进行1，000次重复的自举分析以获得系统发育树的置信度。
结果
样本概述与RT-PCR筛查
2022年至2024年期间，在托斯卡纳中部-南部共采集了3，732只个体，包括白纹伊蚊、尖音库蚊和白蛉亚科物种。基于物种、性别和捕获区域，将收集的个体分成总共110个批次池。使用泛引物进行RT-PCR筛查，在67个批次池中检测到白蛉病毒和/或黄病毒阳性。2024年季节的阳性率最高，尤其是黄病毒的检出率达到56.3%。此外，还观察到一定比例的批次同时感染白蛉病毒和黄病毒，提示存在共感染现象。不同物种的阳性率存在差异，例如2024年在白纹伊蚊中白蛉病毒的检出率较高，而尖音库蚊则对黄病毒表现出最高的阳性率。
托斯卡纳采集蚊虫与沙蝇的病毒组分析
从67个RT-PCR阳性池中，选择了42个样本进行宏基因组测序分析。其中，35个池产生了病毒读长。这些样本中鉴定出来自14个不同科的病毒，其中相当一部分仍未分类。最常检测到的病毒属属于黄疸病毒科、幻影病毒科、番茄丛萎病毒科、新摸病毒科、中核糖核酸病毒科、白纤病毒科和野田村病毒科等家族。此外，许多被分析的序列在GenBank分类中被记录为未分类的病毒目/科。分析还发现了一些病毒具有物种特异性。例如，温州索贝莫样病毒4型似乎仅由白纹伊蚊传播。类似地，尖音库蚊相关突尼斯病毒根据其分类名称，仅在尖音库蚊属中发现。在实验室从幼虫饲养的个体中也检测到某些病毒，如温州索贝莫样病毒4型和尖音库蚊相关突尼斯病毒，表明可能存在经卵传播。其他高流行率病毒包括白纹伊蚊幻影病毒、白纹伊蚊安菲病毒、沃勒菲尔德病毒、大城洞病毒以及属于小RNA病毒目的病毒。总体而言，这些病毒的宿主储存库存在差异：一些昆虫特异性病毒主要在白纹伊蚊中检测到，而另一些则优先在尖音库蚊中发现。只有少数病毒是白蛉亚科物种固有的。值得注意的是，在单个白蛉亚科物种池中鉴定出了属于白蛉病毒属、广泛分布于北非并能感染人类的蓬尼科病毒。宏基因组分析显示该病毒的三基因组节段均存在，测序覆盖良好。BLAST分析表明，该意大利蓬尼科病毒基因组序列与2008年在突尼斯分离的PI-B4-2008毒株具有高度同源性，这首次证明了蓬尼科病毒在意大利的存在和传播。
主要病毒家族的地理分布
通过NGS鉴定的主要病毒家族的地理分布揭示了所调查的两个托斯卡纳地区之间蚊虫病毒组的差异。具体而言，与格罗塞托地区的样本相比，锡耶纳地区的样本检测到更多样化的昆虫特异性病毒。例如，黄病毒科、野田村病毒科、番茄丛萎病毒科和新摸病毒科的成员似乎定殖于锡耶纳地区的白纹伊蚊和尖音库蚊，而未在格罗塞托的样本中检测到。相反，小RNA病毒目相关的重叠群仅在格罗塞托的样本中发现。尽管如此，黄疸病毒科、内格病毒目、核糖病毒域和幻影病毒科在两个地区均存在，尽管它们对蚊虫病毒组组成的影响各不相同。
系统发育分析
对覆盖率较高且在样本中更具代表性的病毒的全基因组序列进行了系统发育分析。结果显示，大多数意大利的尖音库蚊相关突尼斯病毒序列与在突尼斯分离的病毒株聚集在一起。而对于温州索贝莫样病毒4型，大多数样本形成了一个与已提交的参考序列不同的独立分支。关于白纹伊蚊安菲病毒，系统发育树显示意大利样本形成了与亚洲株而非美洲株进化关系更密切的独立分支。对于白纹伊蚊幻影病毒，大多数意大利样本形成了与中国参考株不同的独立分支。关于小RNA病毒目病毒，系统发育分析揭示了大多数意大利样本与瑞士株具有高度相似性。而映射到小核糖核酸病毒基因组上的序列显示，所有样本都被归类为在不同国家分离的湖北小核糖核酸样病毒。对于大城洞病毒2型，所有样本都与在韩国分离的大城洞样病毒株显示出高度的序列同一性。
讨论
本研究对三年期间在意大利托斯卡纳中部-南部锡耶纳和格罗塞托地区收集的蚊虫和沙蝇种群进行了高通量RNA测序，以调查与这些媒介相关的病毒多样性。研究发现了多种昆虫特异性病毒。一些病毒在所有蚊属中都有发现，而另一些则具有属特异性。研究结果表明，两种蚊种具有不同的病毒属，其组成和频率存在显著差异。在所鉴定的昆虫特异性病毒中，白纹伊蚊幻影病毒、白纹伊蚊安菲病毒、尖音库蚊黄疸样病毒4型以及小核糖核酸病毒科的病毒更为普遍。这些病毒在白纹伊蚊和尖音库蚊中均有检测到，表明可能存在属间传播。值得注意的是，在从幼虫饲养的成蚊中检测到白纹伊蚊幻影病毒和白纹伊蚊安菲病毒，提示了潜在的经卵传播途径。关于意大利的小核糖核酸样病毒，大多数菌株与瑞士菌株高度匹配，这提示气候变化及人员流动等因素可能有助于这两种病毒谱系在边境国家间的传播。
研究中鉴定出的大量昆虫特异性病毒在GenBank分类中被报告为未分类，其中尖音库蚊相关突尼斯病毒和温州索贝莫样病毒4型发生率较高，且分别显示出对尖音库蚊和白纹伊蚊的宿主特异性。这两种病毒在实验室饲养自幼虫的成蚊中存在，暗示了它们的垂直传播和环境持久性。值得注意的是，先前仅在韩国和澳大利亚报告过的大城洞病毒2型，在库蚊和白蛉中均被鉴定，这标志着它在旧世界蚊虫中的首次发现。此外，本研究首次提供了意大利白蛉的初步病毒组数据，证明了番茄丛萎病毒科、白纤病毒科和野田村病毒科病毒在白蛉亚科物种中的流行，为白蛉亚科的病毒生态学提供了新见解。
病毒宿主特异性通常将昆虫特异性病毒限制在某些节肢动物中，但环境和气候因素可以塑造病毒组的组成。主要鉴定病毒家族的地理分布导致了两个托斯卡纳地区间蚊虫病毒组的不同分布。研究观察到地理差异，例如黄病毒科、野田村病毒科、番茄丛萎病毒科和新摸病毒科在锡耶纳样本中发现但不在格罗塞托，而小RNA病毒目则为格罗塞托样本所独有，这提示了蚊虫活动区域与发现病毒物种多样性之间的严格相关性。然而，不同地点样本数量的差异可能引入偏差，突显了未来需要更平衡采样的必要性。
除在一个锡耶纳省采集的白蛉样本中检测到蓬尼科病毒外，未鉴定出潜在的人类致病病毒。蓬尼科病毒于2008年在突尼斯北部的沙蝇中发现和分离，现在被归类为白纤病毒科白蛉病毒属中蓬尼科白蛉病毒物种的独特成员。尽管尚未被证明具有致病性，但已在突尼斯的人类中发现了蓬尼科病毒的血清阳性率，尽管与主要的托斯卡纳病毒相比发生率较低。此外，样本中的几个未识别读长与非病毒读长相关，但它们也可能对应于新的、未分类的病毒。
通过宏基因组测序方法，还在大多数样本中检测到了非病毒读长的存在，主要以沃尔巴克氏体属为代表，这是一种常见于多种无脊椎动物类群的专性细胞内细菌。已有文献记载沃尔巴克氏体能够为蚊虫提供对某些病毒感染的抗性，并已被建议作为媒介传播疾病控制的潜在工具。
总而言之，在托斯卡纳，蚊虫和沙蝇携带多样化的病毒组，并具有不同的地理模式。锡耶纳地区的白纹伊蚊主要携带温州索贝莫样病毒、白纹伊蚊幻影病毒和白纹伊蚊安菲病毒，而锡耶纳和格罗塞托的尖音库蚊则与尖音库蚊相关突尼斯病毒和小RNA病毒目相关。此外，锡耶纳的白蛉携带蓬尼科白蛉病毒，突出了物种特异性的病毒多样性和病毒传播的局部差异，尽管这些病毒目前不构成对人类健康的威胁。然而，考虑到某些物种的样本量有限，这项研究很可能只代表了整体蚊虫病毒组的一个有限观察。尽管如此，研究结果为深入了解蚊媒病毒的生态学和进化提供了见解，并强调了持续监测对公共卫生潜在威胁的必要性。
