《Aquaculture》：Flow cytometry–based prediction of survival-linked microbial indicators in barramundi larviculture: Early warning via phenotypic fingerprints
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巴沙鱼孵化场通过流式细胞术与16S rRNA测序结合，鉴定出54个差异丰度的微生物标记物（ASVs），其中4个有害菌属（Citrobacter、Rhodopseudomonas、Arcobacter）在孵化后0天即可预测存活率，机器学习模型准确度达AUC≤0.74，为建立早期高throughput监测工具提供新方法。
作者：Ngoc Minh Ngan Bui、Ruben Props、Tom Defoirdt、Nico Boon
比利时根特大学微生物生态与技术中心（CMET），地址：Frieda Saeysstraat 1，9052根特
摘要
尽管微生物群落在水产养殖中对幼体健康至关重要且具有动态性，但可靠的早期预警工具仍然十分匮乏。在本文中，我们结合了流式细胞术（FCM）和16S rRNA基因测序技术，以识别能够预测巴拉蒙迪鱼（Lates calcarifer）孵化场幼体存活情况的微生物指标。测序结果发现了54种扩增子序列变异体（ASVs），这些变异体能够显著区分存活率高的孵化池和存活率低的孵化池。基于134个FCM表型特征的机器学习模型能够准确推断出这些ASVs的丰度，并在20个独立的幼体养殖批次中再现了与存活率相关的模式（n = 1206）。四种有害的ASVs——Citrobacter（asv28、asv78）、Rhodopseudomonas（asv6）和Arcobacter（asv47）——与较低的存活率相关，其鉴别信号早在孵化后第0天（DPH 0）就能被检测到。基于这些标记物在DPH 0时建立的分类模型具有中等准确性（AUC ≤ 0.74），表明微生物特征可以在死亡率在DPH 4–5天变得明显之前预测存活轨迹。值得注意的是，仅使用基于FCM的分类器在DPH 0时也能捕获足够的鉴别信息，为快速、高通量的监测提供了实用方法。总体而言，我们的发现确立了将FCM与测序相结合作为推导微生物存活标志物的有效途径，从而有助于在水产孵化场中实施主动管理。
引言
幼体养殖的成功与养殖系统中的微生物群落组成密切相关（Vadstein等人，2018a）。例如，由Bacillus licheniformis和B. amyloliquefaciens组成的益生菌混合物可将鱼苗的存活率提高2.5倍，并增强其运输后的抗性；这些效果与养殖系统中微生物群的变化有关（Tarnecki等人，2019）。同样，向欧洲海鲈鱼幼体池中添加一种本土的Phaeobacter菌株可暂时改变细菌群落结构，并显著提高幼体的存活率、生长能力以及对Vibrio harveyi的抵抗力（Makridis等人，2021）。孵化场水中存在多种细菌，从潜在的病原体到无害的共生菌和有益的益生菌都有（Niu等人，2023；Paralika和Makridis，2025）。维持平衡的微生物群落对于支持幼体发育和确保高存活率至关重要（Niu等人，2023；Vadstein等人，2018b）。事实上，Infante-Villamil等人（2021）回顾了多项水产养殖物种的微生物组研究，发现较低的微生物多样性与不健康的动物相关。
定期监测微生物组是必要的，因为鱼卵、活饵料和进水是机会性细菌的主要来源，它们强烈影响着养殖水的微生物组以及幼体的微生物定植、健康状况和存活率（Califano等人，2017；Paralika和Makridis，2025）。孵化场的微生物监测通常与关键生产节点（产卵、孵化、首次喂食、转移）相关联，需要定期对养殖水、活饵料和幼体进行采样。例如，虾类孵化场的规范（FAO，2007）建议在特定幼体阶段（无节幼体、第二期 Zoea、第二期 Mysis）使用TCBS琼脂进行细菌学评估，并通过PCR筛查病毒病原体，通常在收获前2–3天进行一次筛查，或在周期内的无节幼体阶段和PL5阶段进行两次筛查。相比之下，像16S rRNA基因测序这样的全面群落分析方法迄今为止主要应用于研究领域（Syropoulou等人，2020）。同样，实时监测微生物群落组成对于管理鱼类孵化场的健康和生产力至关重要。
传统的基于培养的方法（如异养平板计数）用于微生物群落分析往往劳动强度大且存在局限性，通常只能检测到总微生物群的不到1%（Paralika和Makridis，2025；Rastogi和Sani，2011）。虽然16S rRNA基因测序能够提供微生物群的广泛视图，但其在大规模水产养殖中的常规应用受到劳动力需求和高时间分辨率应用难度的限制（Bharti和Grimm，2021；Nearing等人，2021）。这凸显了需要快速工具来追踪孵化场环境中微生物群的快速动态变化。
流式细胞术（FCM）通过每秒分析数千个单个细胞，提供了一种快速、高通量的微生物群落分析方法（Mattelin等人，2025）。通过直接计数细胞，FCM能够快速量化细菌负荷并检测群落结构的变化，比平板计数或测序快得多（Rubbens等人，2021；Rubbens和Props，2021）。越来越多的证据表明，细胞计数结果不仅可以作为细菌总丰度的代理指标。在不同水生系统中的研究表明，FCM得出的多样性测量结果与16S rRNA基因测序得到的多样性估计值高度一致（Heyse等人，2021；Props等人，2016，Props等人，2018）。换句话说，某些细菌类群的存在可以在流式细胞术读数中留下特征性模式，即使这些类群在实验中没有被直接标记。
利用这一联系，最近的研究表明机器学习模型可以利用流式细胞术数据推断微生物群落的分类组成。Rubbens等人（2017）在计算模拟的群落中展示了这种方法，证明在无菌培养条件下训练的监督模型能够从FCM数据中高精度地识别细菌细胞。在此基础上，Rubbens等人（2019）在淡水湖泊中应用了随机套索模型，将细胞计数的高核酸含量组和低核酸含量组与驱动生态系统功能的特定细菌类群联系起来。?zel Duygan等人（2020）开发了CellCognize这一神经网络工具，能够对环境样本中的细胞类型进行分类并预测群落变化。Heyse等人（2021）进一步证明，在流式细胞术数据上训练的监督模型能够可靠地预测水产养殖系统中细菌类群的存在和丰度。van de Velde等人（2022）表明，基于FCM的监督分析能够快速量化肠道共培养物中的细菌种类，其效果与测序相当。这些研究共同证明了流式细胞术在复杂微生物群落分类预测中的可行性。
本研究旨在通过以下方式开发和验证巴拉蒙迪鱼孵化场的预测模型框架：（i）识别区分高存活率和低存活率结果的ASVs（扩增子序列变异体）；（ii）训练机器学习模型直接从细胞计数特征推断这些类群的丰度；（iii）测试基于ASV信息和FCM的模型是否能够提供早期、高通量的幼体存活指标。据我们所知，这是首次尝试在水产孵化场中开发一种从流式细胞术数据推断与幼体存活相关的类群丰度的预测框架。最终，我们评估这些模型是否可以作为早期、高通量的养殖结果指标。从应用角度来看，该框架为将微生物群落信息整合到常规孵化场监测中提供了基础，旨在识别与不同存活轨迹相关的早期微生物特征，从而支持基于数据的决策。
研究设计与采样策略
本研究基于之前在越南一家大型巴拉蒙迪鱼（Lates calcarifer）孵化场进行的大规模采样活动中收集的FCM和16S rRNA基因测序数据（n = 136个样本）（Bui等人，手稿正在审稿中）。简而言之，巴拉蒙迪鱼苗在孵化后经过18天的培养，在八个并行的10,000升养殖池中生长，整个过程在受控条件下进行。
受精卵在转移到养殖池之前先孵化24小时
与存活结果相关的ASVs识别
通过应用严格的筛选标准（调整后的p-值<0.05，|log?倍数变化|>2，基础均值>2），DESeq2分析识别出54种在高存活率和低存活率组之间存在显著差异的ASVs（图1A）。其中，24种在存活率高的孵化池中富集，30种在存活率低的孵化池中富集（见图2）。
使用Z-得分标准化的热图可视化了这54种差异丰度ASVs的分布情况（补充图1）。热图显示了不同的群落特征
讨论
在这项研究中，我们将流式细胞术在水产养殖中的应用从描述性群落分析扩展到了更高级的应用。虽然早期的研究主要利用流式细胞术来监测多样性指数或广泛的群落变化（Props等人，2016，Props等人，2018），但我们展示了监督式机器学习可以将细胞计数特征转化为与巴拉蒙迪鱼养殖中幼体存活率直接相关的预测性ASV模型。我们的方法并不旨在重建整个微生物群落，而是……
CRediT作者贡献声明
Ngoc Minh Ngan Bui：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、调查、数据分析、概念化。
Ruben Props：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、软件开发、资源协调、项目管理、方法学、调查、资金获取、概念化。
Tom Defoirdt：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源协调、方法学、调查、概念化。
Nico Boon：
资金声明
N.M.N·B.获得了佛兰德斯创新与创业机构（VLAIO）的Baekeland Ph.D.奖学金（HBC.2022.0705）以及Kytos BV的支持。
利益冲突声明
我们声明Ngoc Minh Ngan Bui和Ruben Props是Kytos BV的员工和/或董事；然而，这一隶属关系并未影响研究设计、数据分析或结果解释。
