CRISPR/Cas9介导的mstnb基因敲除增强了耐盐罗非鱼的肌肉生长

《Aquaculture》：CRISPR/Cas9-mediated mstnb knockout enhances muscle growth in salt-tolerant tilapia

基因编辑技术用于莫桑比克非洲鲤鱼mstnb基因敲除研究，显示其生长性能显著提升，肌肉纤维增粗，淡水条件下繁殖不受影响，但肝脏组织出现空泡，肌肉中Omega-3比例提高。

　　

作者：杨子拓（Zituo Yang）、王乐（Wang Le）、孙飞（Fei Sun）、黄杰伊（Joey Wong）、李梅（May Lee）、华月根（Gen Hua Yue）

地点：新加坡国立大学淡马锡生命科学实验室（Temasek Life Sciences Laboratory），1 Research Link，SG 117604，新加坡

摘要

生长是水产养殖中的关键特征，直接影响生产力和经济价值，而有针对性的基因操作有可能提高生长性能。在这项研究中，我们利用CRISPR/Cas9技术生成了一种纯合的mstnb敲除型莫桑比克罗非鱼。我们还在淡水和海水条件下评估了它们的生长情况、形态特征、组织学特性、选定的基因转录本以及肌肉脂肪酸组成。mstnb^?/?鱼表现出显著的生长增强，同时伴有肌肉纤维肥大和体横截面尺寸的增加。生殖特征（包括生殖腺组织学、性别相关基因表达dmrt1和amh）以及在淡水中的生育能力基本未受影响。在肝脏中观察到组织学空泡化现象，并且nrf2 mRNA表达降低，而sod2没有变化。肌肉脂肪酸分析显示n-3多不饱和脂肪酸（DHA和EPA）水平升高，omega-3/omega-6比例增加。这些发现表明mstnb基因的破坏促进了肌肉生长，在淡水条件下对生殖的影响有限。这些结果突显了这种方法在水产养殖生产中的潜在价值，但需要在商业条件下进一步验证。

引言

随着世界人口持续增长以及捕捞渔业面临生态和经济限制，水产养殖在确保全球粮食和营养安全方面发挥着关键作用（Brye, 2023; FAO, 2024）。作为可持续发展的关键组成部分，水产养殖直接为联合国可持续发展目标（SDGs）做出贡献，特别是“消除贫困”和“零饥饿”，通过支持生计和提高食物供应（Haque and Mahmud, 2025; Yumnam et al., 2024）。在这种情况下，选择和改良具有快速生长率、广泛环境适应性和高经济价值的水产养殖物种对于优化生产效率至关重要（Gjedrem et al., 2012）。罗非鱼（Oreochromis spp.）是全球养殖最广泛的鱼类之一，因其生长迅速、饲料转化效率高、环境适应性强和消费者接受度高而在120多个国家进行养殖（Webster and Lim, 2024; Yue et al., 2016）。虽然尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是最受欢迎的海水养殖物种之一（Webster and Lim, 2024），但其泥土气味仍然是一个主要缺点。耐盐的莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）因其广盐性能力和相对温和的味道而受到青睐，尽管气味会因养殖系统和管理方式而异（Yue et al., 2024）。这种生理适应性使其成为咸水和海水养殖系统的理想选择，例如沿海地区和咸水内陆水域（Inokuchi et al., 2022）。然而，其生长速度明显慢于淡水尼罗罗非鱼（Yue et al., 2024）。因此，提高其生长速度对于实现盈利和可持续的水产养殖至关重要。尽管在养殖管理、饲料配方和选择性育种方面取得了进展（Yue et al., 2024），但进一步提高经济重要性特征（如体生长率、肌肉产量和营养成分）仍然是罗非鱼养殖的核心目标，尤其是对于耐盐罗非鱼。传统的育种方法已经改善了一些罗非鱼品系的生长和生殖特征（Mair et al., 1997; Yá?ez et al., 2020）。例如，通过YY超级雄性育种计划或激素性别反转技术产生了全雄性群体（Mair et al., 1997; Yá?ez et al., 2020）。然而，传统育种方法的进展受到关键基因的复杂多基因结构和环境对表型变异的显著影响，这些因素共同限制了选择性改良的精确性和效率（Gjedrem et al., 2012; Yang et al., 2025）。随着基因组编辑技术（尤其是CRISPR/Cas9）的出现，对水产养殖物种进行精确的基因修饰已成为可能，从而能够针对与所需特征相关的特定基因进行改良（Gratacap et al., 2019; Gu et al., 2022; Yang et al., 2025; Yang et al., 2022）。

肌抑素（MSTN）属于TGF-β超家族，是已知的脊椎动物肌肉生长的负调控因子（Thomas et al., 2000）。哺乳动物mstn基因的功能丧失突变导致了双肌肉表型（Han et al., 2019）。在硬骨鱼类中，mstna或mstnb编码的MSTN同源蛋白的功能性敲除或敲低同样提高了斑马鱼、青鳉、沟鲶、尼罗罗非鱼和普通鲤鱼的生长性能（Gao et al., 2016; Khalil et al., 2017; Wu et al., 2023; Yeh et al., 2017）。然而，迄今为止的大多数研究都集中在单一环境（淡水）条件下，关于mstnb缺乏在海水条件下的生理和代谢后果知之甚少。此外，除了生长指标外，很少有研究评估mstnb敲除对组织组成的影响，特别是脂肪酸组成。肌肉脂肪酸组成，尤其是omega-3/omega-6比例，在决定饮食健康益处方面起着关键作用（Gutierrez-Guerra et al., 2025）。

Omega-3长链多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs），包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），是人类健康所需的必需营养素（Hei and Sanahanbi, 2023）。提高水产养殖产品中的这些脂肪酸水平是提升其营养价值的主要目标。然而，养殖的淡水罗非鱼通常EPA和DHA含量较低，而omega-6含量较高，尤其是在喂食植物性饲料的情况下。食物中omega-3/omega-6比例较低（< 1）会降低其对人类健康的营养价值，并限制其在预防心血管和代谢疾病方面的潜在益处（Visentainer et al., 2005）。结合基因改良和环境优化的策略，如在海水中养殖，可能通过同时提高生长、肌肉脂质含量和omega-3含量来提供协同效益（Glencross et al., 2025）。

在这项研究中，我们使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术生成了一种纯合的mstnb敲除型莫桑比克罗非鱼品系，并系统地评估了它们在淡水和海水条件下的生理表现。我们评估了体重、体长、肌肉和肝脏组织学、与生长和代谢相关的基因表达以及肌肉脂肪酸组成。主要目标是：（1）确定mstnb敲除是否在淡水和海水环境中都能促进生长；（2）评估生殖腺组织学、性别相关基因表达和生育能力（在淡水条件下），以了解潜在的生殖权衡；（3）评估mstnb破坏是否影响肌肉中的脂肪酸组成。我们的发现为mstnb在广盐性鱼类中的作用提供了新的见解，并展示了基因组编辑在多种养殖环境中提高水产养殖生产力和产品质量的潜力。

伦理声明

所有涉及动物的实验程序均遵循新加坡淡马锡生命科学实验室（TLL）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的伦理指南和规定。本研究的方案已获得IACUC批准，批准号为TLL(F)-22–004。所有动物处理和实验操作均符合既定的机构和国家标准。

莫桑比克罗非鱼中mstnb空等位基因的生成和验证

为了生成mstnb敲除品系，我们使用CRISPR/Cas9方法，针对mstnb开放阅读框（ORF）的第一个外显子设计了gRNA（图1A）。共有350个受精卵被注入gRNA–Cas9混合物，存活率为13.7%（48/350）。对存活的F?鱼进行基因分型后，发现有22个个体在目标位点携带突变（45.8%，22/48）。这些F?突变体与野生型鱼杂交产生了F?代，其中出现了六种缺失类型

mstnb敲除在莫桑比克罗非鱼中生成了稳定的突变品系

在这项研究中，我们利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑成功建立了mstnb敲除型莫桑比克罗非鱼品系。所使用的gRNA和Cas9蛋白浓度与尼罗罗非鱼和杂交罗非鱼的研究相当（Li et al., 2014; Liu et al., 2026）。莫桑比克罗非鱼的一个主要技术挑战在于微注射过程，因为它们的卵含有一个较大的卵黄团。在早期发育阶段，细胞质会向动物极移动形成一个小

CRediT作者贡献声明

杨子拓（Zituo Yang）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念化。王乐（Wang Le）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，调查，正式分析。孙飞（Fei Sun）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证。黄杰伊（Joey Wong）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，调查，正式分析。李梅（May Lee）：撰写 – 审稿与编辑，

利益冲突声明

作者们没有利益冲突。

致谢

我们感谢淡马锡生命科学实验室的内部支持，以及陈斌博士（Dr. Bin Chen）在使用GC–MS分析脂肪酸组成方面提供的帮助。