《Aquaculture》：Application of ultrasound-based maturational status assessment in the management of female rainbow trout broodstock
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本研究通过每周超声成像监测虹鳟鱼卵成熟度，发现部分或完全黑化的卵母细胞预示下周排卵，并证实超声技术可优化卵剥离时间，提升卵质量，减少胚胎损失。
格雷戈里·M·韦伯（Gregory M. Weber）| 卢克·R·伊瓦诺维奇（Luke R. Iwanowicz）| 马克·A·霍斯图特勒（Mark A. Hostuttler）| 吉尔·E·伯基特（Jill E. Birkett）| 蒂莫西·D·利兹（Timothy D. Leeds）
美国农业部，农业研究服务局，国家冷水与冷水养殖中心，美国西弗吉尼亚州基尔尼斯维尔（US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, National Center for Cool and Cold Water Aquaculture, Kearneysville, WV, USA）
摘要
本研究评估了每周使用超声波成像技术来提高卵子质量并预测雌性虹鳟（Oncorhynchus mykiss）排卵时间的效果。当鲑科鱼类接近产卵期并开始卵子成熟时，由于细胞质清透明化，卵子的回声特性会降低。这导致超声图像从浅灰色迅速变为黑色。在七个产卵季节中，研究人员每周对卵子的回声特性进行了监测，并记录了排卵前一周处于不同成熟阶段的雌性鱼体内的胚胎发育情况。超过90%的具有部分黑色或完全黑色卵子的鱼在接下来的一周内排卵。平均而言，44%的排卵鱼在之前的超声图像中显示有部分或完全黑色的卵子，表明它们在卵子成熟开始后大约三天内排卵。对于每条被确定为成熟或正在成熟的雌鱼，有2.40±0.10条鱼在接下来的一周内排卵（R2 = 0.83），从而能够可靠地预测接下来的排卵率。那些在排卵前一周首次出现部分或完全黑色卵子的雌鱼，其胚胎发育率较低（39.3±4.59%），而那些仍处于未成熟状态（浅灰色卵子）的雌鱼胚胎发育率为52.5±4.11%。未能在卵子成熟后一周内排卵的雌鱼，其卵子质量会迅速下降。将超声波成像技术纳入孵化场的产卵检查流程中，可以提供优化卵子采集时间的信息，以最大化卵子质量，识别产卵质量较差的雌鱼，并提高对亲鱼排卵率的短期预测能力。
引言
大多数鲑科鱼类，包括虹鳟，在人工饲养条件下能够排卵，但无法自行产卵（Bry, 1981; Aegerter and Jalabert, 2004）。因此，必须手动将排卵后的卵子从鱼体内取出。卵子质量可能在排卵后一周内开始下降，温度在这一过程中起着关键作用（Springate et al., 1984; Aegerter and Jalabert, 2004; Samarin et al., 2008; Weber and Hostuttler, 2012）。关于排卵后卵子质量下降的原因已受到广泛关注（例如Rime et al., 2004; Aegerter et al., 2005; Ma et al., 2015, Ma et al., 2016）。由于卵子质量下降的时间窗口较短，孵化场通常每周会对预期排卵的每条雌鱼进行产卵检查，方法是通过对腹部施加压力来检查是否有可排出的卵子。由于大多数虹鳟的产卵季节持续约三个月，因此需要在整个季节内多次处理这些鱼（Weber et al., 2023）。这对孵化场工作人员来说工作量很大，也对鱼本身造成压力。如果未能在卵子成熟后一周内识别出已经排卵的雌鱼，不仅会导致可存活胚胎的丢失，未受精或未发育的卵子还会成为细菌和真菌滋生的温床。虹鳟卵在孵化前通常会被送往育苗场，在这个阶段称为“胚胎发育期”（Weber et al., 2016）。在胚胎发育期去除死亡或发育不良的卵子和胚胎同样需要大量人力。目前的产卵检查程序仅限于每周观察是否有可排出的卵子，这些信息对于提高卵子质量或可靠预测近期排卵率帮助不大。
超声波成像分析已被用于多种物种，以测量生殖腺和卵泡的大小、确定性别以及估计生殖腺的成熟阶段（Mattson, 1991; Novelo and Tiersch, 2012; Hliwa et al., 2014; Naeve et al., 2018）。鲑科鱼类的卵子在不同发育阶段具有不同的声学特性或回声特性（Reimers et al., 1987; Evans et al., 2004; Segret et al., 2022）。未成熟的卵子具有高回声特性，因此在超声图像中呈现为浅灰色至白色。排卵前的雌鱼卵膜具有高回声，但卵子内容物呈低回声或无回声。在超声图像中，这表现为被亮环包围的黑色卵子（Reimers et al., 1987; Evans et al., 2004）。从高回声到无回声的转变是由于卵子成熟过程中细胞质的变化。在卵子生长的大部分时间里，包括卵黄生成阶段，卵子都处于减数分裂I期的停滞状态。卵黄生成后，促性腺激素的增加以及成熟诱导激素17α,20β-二羟基-4-孕烷-3-酮的产生会导致卵子成熟并最终排卵（Nagahama, 1997）。卵子成熟包括核成熟和细胞质成熟。核成熟涉及卵子核或生殖泡的变化，这与减数分裂的重新启动有关。细胞质成熟包括膜结合的卵黄颗粒融合成中央卵黄团以及水分的增加，这导致卵子细胞质的清透明化，从而使卵子的回声特性降低（Jalabert et al., 1978; Patino and Sullivan, 2002; Lubzens et al., 2010; Segret et al., 2022）。细胞质的清透明化发生在卵子生殖泡分解之前，这一现象常被用作减数分裂重新启动的标志（Jalabert et al., 1978; Bry, 1981）。
由于排卵后卵子质量会下降，因此准确预测即将发生的排卵对于孵化场的卵子采集时机非常宝贵。超声波技术可以无创地监测卵子成熟的进程，其中细胞质成熟的迹象是卵子中心出现无回声区域，并随着细胞质清透明化的进展而扩展（Segret et al., 2022）。雌性虹鳟通常在这一转变开始后的四天内排卵，这提供了一个无创的标志，表明鱼即将排卵（Scaratt, 2015; Segret et al., 2022）。此外，通过分析成熟阶段还可以识别出卵子质量较差的雌鱼。最近的研究表明，在虹鳟中，从细胞质清透明化完成到排卵的成熟阶段时间会受到水质离子含量的影响，这也会降低胚胎的发育成功率和质量（Segret et al., 2022）。
工业界已经采用超声波技术进行鲑科鱼类的性别鉴定。这包括利用深度学习辅助的自动化系统来区分未成熟的卵子和已完成细胞质成熟的卵子（Yari et al., 2024a, Yari et al., 2024b）。尽管对鲑科鱼类卵巢进行超声波检查在技术上简单、快速且不需要高端设备，但这项技术尚未被纳入常规的产卵检查流程中。阻碍其广泛应用的一个限制是缺乏评估其在实际孵化场工作中潜在益处的研究。据我们所知，利用超声波技术提前识别卵子质量问题或预测多个季节的排卵率的研究仍不充分且未得到量化。此外，以往基于超声波的研究主要针对实验室中的少量个体或野生鱼类（Reimers et al., 1987; Evans et al., 2004; Carim et al., 2021; Segret et al., 2022）。我们在国家冷水与冷水养殖中心（NCCCWA）使用超声波技术已有十年以上，用于识别与卵子成熟相关的回声变化，以提高选择性育种程序的效率。在本研究中，我们利用七年间由孵化场工作人员收集的数据，评估了每周通过超声波筛查雌性亲鱼来预测短期排卵率的效果，并提供可操作的信息以改善胚胎发育率。通过每周产卵检查有效识别出已进入卵子成熟阶段的雌鱼，有助于提高孵化场运营和选择性育种的效率。
实验动物和孵化场程序
动物饲养程序已获得西弗吉尼亚州利敦（Leetown, WV）的机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）的批准，符合美国农业部农业研究服务局（USDA, ARS）的政策和程序130.4.v.3。研究中的动物属于NCCCWA的选择性育种计划，包括2015–2025年的鱼群。所有参与选择性育种的雌鱼都被纳入研究。大多数雌鱼在两岁时首次产卵。
排卵前一周处于不同成熟阶段的雌鱼比例
仅对2015年和2016年的鱼群分别收集了II类和III类雌鱼的比例及胚胎发育率数据。从2017年开始，我们在进行超声波检查时不再区分II类和III类卵子的雌鱼。数据合并的部分原因是2017年我们改变了检查方式：之前是由具有超声波检查经验的人员单独操作，后来改为孵化场工作人员在产卵检查时快速进行扫描。
讨论
价格合理的超声波系统能够提供具有足够分辨率的实时超声图像，从而在排卵前三天内识别出雌鱼，这对孵化场操作和研究具有重大潜力。我们在NCCCWA多年来的每周产卵检查数据显示，成像分析可以提供可操作的信息，以降低卵子过度成熟的风险，识别出产卵质量较低的雌鱼。
作者贡献声明
格雷戈里·M·韦伯（Gregory M. Weber）：撰写初稿、项目管理、方法学设计、实验实施、数据分析、概念化。
卢克·R·伊瓦诺维奇（Luke R. Iwanowicz）：撰写与编辑、方法学设计、实验实施、数据分析。
马克·A·霍斯图特勒（Mark A. Hostuttler）：撰写与编辑、监督工作、方法学设计、实验实施、数据分析。
吉尔·E·伯基特（Jill E. Birkett）：撰写与编辑、实验实施、数据分析。
蒂莫西·D·利兹（Timothy D. Leeds）：撰写与编辑。
资金支持
本项工作得到了美国农业部农业研究服务局CRIS项目（项目编号：8082-31000-013-00D）“提高虹鳟养殖效率的综合研究方法”（“Integrated Research Approaches for Improving Efficiency in Rainbow Trout”）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究结果。
致谢
作者还要感谢NCCCWA的亲鱼和湿实验室工作人员对动物的照料以及数据收集方面的协助。本文中使用的公司名称仅出于提供信息和方便读者的目的，并不代表美国农业部或农业研究服务局对任何产品的官方认可或推荐，也不排除其他可能适用的产品或服务。美国农业部是一个提供平等机会的雇主。
