《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：PFKFB3-driven glycolysis in endothelial cells activates RhoA/ROCK1 to promote pulmonary vascular leakage in heatstroke
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热应激与LPS共同作用下，内皮细胞屏障功能障碍是中暑引发急性肺损伤的关键因素，但其代谢机制尚不明确。本研究旨在探讨PFKFB3介导的糖酵解是否通过激活RhoA/ROCK轴破坏内皮屏障完整性。研究结果显示，在热-LPS应激下，PFKFB3表达上调，激活糖酵解，进而激活RhoA/ROCK1/MLC2信号通路，导致细胞骨架重排、细胞连接破坏和血管通透性增加。靶向抑制PFKFB3-RhoA/ROCK1轴可恢复内皮屏障功能，这为中暑诱导的肺血管损伤提供了新的治疗靶点。
随着全球气温上升和极端热浪事件日益频繁，与中暑相关的死亡率正以惊人的速度增长。在重症监护下，劳力性中暑和经典型中暑的死亡率分别高达26.5%和63.2%。中暑不仅是一种危及生命的临床综合征，其特征不仅是直接的热细胞毒性，还包括全身性紊乱，例如严重的内毒素血症、循环衰竭、凝血病、暴发性全身炎症反应和多器官功能障碍综合征。其中，急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征是中暑最严重的并发症之一。肺微血管内皮细胞同时受到直接热应激和LPS等细胞毒性介质的损伤，导致内皮通透性增加、病理性液体外渗和肺泡水肿，最终造成气体交换障碍和呼吸衰竭。虽然已知内皮炎症反应深受代谢重组的影响，尤其是糖酵解，但对于PFKFB3（6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3）在中暑诱导内皮损伤中的作用，以及其是否通过激活RhoA/ROCK信号通路导致细胞骨架紊乱和屏障功能障碍，此前仍不清楚。这项研究旨在阐明这一机制，为开发新的治疗策略提供依据。
为了探究这些问题，研究人员利用人肺微血管内皮细胞，构建了热应激（43°C）联合LPS刺激的体外中暑模型。通过使用PFKFB3抑制剂PFK15和针对PFKFB3、RhoA或ROCK的siRNA进行干预，结合代谢通量分析、转录组测序、Western blot、RhoA活性pull-down检测、F-肌动蛋白免疫荧光和FITC-葡聚糖通透性测定等多种技术，系统研究了PFKFB3驱动的糖酵解如何激活RhoA/ROCK通路，进而导致内皮屏障功能障碍。
3. 研究结果
3.1. 热应激和LPS共暴露触发了HPMECs早期糖酵解活化，导致内皮屏障功能障碍
研究人员通过测量ECAR（细胞外酸化率）、OCR（耗氧率）、乳酸和ATP水平，发现热-LPS应激在早期（热应激2小时加LPS处理1小时）显著增强了HPMECs的糖酵解通量，同时ATP产生也转向糖酵解途径。转录组分析证实了PFKFB3上调与促炎细胞因子通路之间的关联。这种应激触发了PFKFB3和RhoA/ROCK1/MLC2信号通路上调，导致了F-肌动蛋白应力纤维的形成、VE-钙黏蛋白的分解和屏障高通透性。
3.2. 热-LPS应激下HPMECs的糖酵解活化具有LPS浓度依赖性
研究显示，热应激协同LPS以浓度依赖性方式驱动HPMECs的代谢和结构重塑。使用亚毒性剂量的LPS（500和1000 ng/mL）进行代谢分析表明，1000 ng/mL处理组在ECAR、OCR、乳酸产生、ATP生成和糖酵解ATP水平方面均显著高于500 ng/mL组。更高浓度的LPS也导致了更强的RhoA活性、ROCK1激活和MLC2磷酸化，并引发更明显的肌动蛋白应力纤维形成、连接蛋白（VE-钙黏蛋白和ZO-1）减少以及更高的内皮通透性。
3.3. 靶向糖酵解改善了热应激和LPS共暴露介导的血管通透性增加
使用PFKFB3选择性小分子抑制剂PFK15干预HPMECs。剂量反应实验表明，10 μM PFK15有效抑制了ECAR和OCR的增加，同时抑制了乳酸和ATP的产生。机制研究进一步揭示，PFK15显著抑制了RhoA-ROCK1-MLC2信号通路的激活，减少了肌动蛋白应力纤维的形成，维持了VE-钙黏蛋白和ZO-1的连接，从而改善了内皮屏障功能。
3.4. PFKFB3调控热-LPS应激下HPMECs糖酵解依赖性内皮高通透性
通过siRNA介导的PFKFB3敲低，证实PFKFB3是热-LPS应激下HPMECs糖酵解的关键调节因子。基因干预有效抑制了热-LPS诱导的ECAR、OCR、乳酸和ATP产生的增加。转录组分析显示，靶向PFKFB3改善了HPMECs中整合的代谢-炎症反应。机制分析进一步表明，PFKFB3沉默显著抑制了RhoA-ROCK1-MLC2信号通路的激活，减少了肌动蛋白应力纤维的形成，保持了连接蛋白的完整性，并改善了内皮屏障功能。
3.5. 抑制RhoA改善了热-LPS诱导的内皮屏障功能障碍
通过药理学抑制和基因沉默方法探究RhoA的作用。使用RhoA特异性抑制剂Rhosin处理HPMECs，15 μM Rhosin显著抑制了RhoA、ROCK1和MLC2的激活。Rhosin还显著减少了应力纤维的形成，恢复了VE-钙黏蛋白和ZO-1的完整性，并保留了内皮屏障功能。同样，siRNA介导的RhoA敲低也显著抑制了RhoA-ROCK1-MLC2信号通路的激活，并产生了与药理学抑制一致的保护效果。
3.6. 抑制ROCK1减轻了热-LPS应激诱导的HPMECs高通透性
在热-LPS刺激前，用ROCK抑制剂Y-27632预处理HPMECs。剂量反应分析显示，10 μM Y-27632有效减弱了MLC2磷酸化，同时免疫荧光定量表明，Y-27632处理显著减少了F-肌动蛋白应力纤维的形成，防止了VE-钙黏蛋白和ZO-1连接破坏，并保持了内皮屏障完整性。热-LPS刺激后，ROCK1和ROCK2的蛋白水平均显著增加。单独的ROCK1沉默显著减弱了热-LPS诱导的ROCK1表达上调和其下游效应物MLC2的磷酸化，并产生了与药理学抑制一致的保护效果。相比之下，ROCK2沉默并未减少MLC2磷酸化、应力纤维形成或连接蛋白破坏，也未改善屏障完整性，表明在此背景下ROCK1起核心作用。
4. 讨论与结论
该研究揭示了热应激和LPS联合处理通过糖酵解依赖性机制破坏了HPMECs的内皮屏障。其潜在的分子机制可能涉及PFKFB3介导的糖酵解通量上调，进而激活RhoA/ROCK1信号轴，导致MLC磷酸化和应力纤维组装。药理学抑制PFKFB3有效缓解了这一病理过程并恢复了内皮屏障完整性。
本研究首次将代谢重组与中暑诱导的肺损伤联系起来。研究发现，PFKFB3驱动的糖酵解是热-LPS应激下内皮细胞激活和屏障破坏的关键代谢开关。糖酵解的增强激活了RhoA/ROCK1通路，进而通过磷酸化MLC和促进肌动蛋白-肌球蛋白收缩，导致细胞骨架重组、内皮细胞连接破坏和血管通透性急剧增加。这一“代谢-炎症-骨架”轴（PFKFB3-RhoA/ROCK1-MLC）的阐明，为理解中暑相关肺血管渗漏提供了新的机制视角。靶向PFKFB3或下游的RhoA/ROCK1信号，可能成为缓解中暑诱导的急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的潜在治疗策略。
这篇题为《PFKFB3-driven glycolysis in endothelial cells activates RhoA/ROCK1 to promote pulmonary vascular leakage in heatstroke》的研究论文，深入揭示了中暑导致肺损伤的新机制，并将代谢调控与细胞骨架动力学联系起来，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。该研究发表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》期刊上。
