优化基于U937细胞的报告系统，以评估乌司替尼（ustekinumab）与曲妥珠单抗（trastuzumab）的ADCC（抗体依赖性细胞杀伤）活性

《Biologicals》：Optimization of a U937 cell-based reporter system to assess ADCC activity of ustekinumab versus trastuzumab

ustekinumab通过中和可溶性IL-12/IL-23而非ADCC机制发挥作用，优化U937细胞IL-12表面表达后验证其作为ADCC检测模型的有效性。

　　

Gandharv Singh Rawat | Rakesh Kumar Sinha | Jayachandran Ramalingam | Amar Shrivastava | Umesh Shaligram | Sunil Gairola

印度血清研究所私人有限公司生物类似物部门，浦那，马哈拉施特拉邦，411028

摘要

在本研究中，人类单核细胞U937系细胞（其本身表达的膜结合型IL-12水平较低）经过系统优化，以建立一个稳健的靶细胞系统，用于替代性ADCC报告基因检测，旨在评估乌司他单抗的效应功能。ADCC活性与作为良好表征的阳性对照物的曲妥珠单抗同时进行评估，采用基于生物发光报告基因的平台。为了诱导表面IL-12的过表达，使用不同浓度的IFN-γ和脂多糖（LPS）刺激U937细胞，并通过FITC标记的抗体染色进行流式细胞术定量分析表达水平，同时通过台盼蓝排除法评估细胞存活率。优化后的效应功能检测表明，仅用25 ng/mL的IFN-γ刺激就足以实现一致且可重复的IL-12表面过表达。这些发现证实，刺激后的U937细胞是评估单克隆抗体相关ADCC机制的可靠靶细胞模型。使用该优化系统结合工程化的Jurkat来源的报告基因效应细胞（表达FcγRIIIa和NFAT响应性荧光素酶构建体），发现乌司他单抗未能诱导可测量的ADCC活性。总体而言，这些结果支持乌司他单抗主要通过中和可溶性IL-12和IL-23细胞因子发挥作用，而非通过FcγRIIIa介导的细胞毒性效应机制。

引言

1897年，Paul Ehrlich首次提出了将抗体作为靶向治疗剂的概念，他设想了能够选择性结合致病微生物的化合物，从而将毒素递送到这些特定目标上[1]。这一早期愿景为现代免疫治疗奠定了基础。随后，对抗体结构、功能及其介导的体液免疫反应的理解不断进步，推动了单克隆抗体（mAbs）作为精确有效治疗手段的发展[2]。

针对可溶性细胞因子或淋巴细胞表面分子的治疗性mAbs在管理多种患者群体的肿瘤学和免疫介导的疾病方面显示出显著疗效。其中一个关键机制是通过结合细胞表面受体来耗尽特定细胞亚型。一个突出的例子是利妥昔单抗，这是一种嵌合的小鼠-人类IgG1 mAb，它特异性地针对某些B细胞上的CD20抗原，主要通过补体依赖性细胞毒性（CDC）触发细胞裂解[3]。在最具影响力的治疗性mAbs和Fc融合蛋白类别中，有一些能够中和肿瘤坏死因子α（TNFα）的抗体，TNFα是一种主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞和T细胞产生的促炎细胞因子。像英夫利昔单抗、阿达利姆单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗和依那西普这样的药物通过阻断TNFα活性，彻底改变了类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎和银屑病等慢性炎症性疾病的治疗[4]。

同样，针对IL-12和IL-23共同p40亚单位的mAbs已成为治疗炎症性疾病的有效疗法。IL-12是一种由p40和p35亚单位组成的异二聚体细胞因子，它与活化T细胞和自然杀伤（NK）细胞上的IL-12Rβ1和IL-12Rβ2受体复合物结合。p40亚单位与IL-12Rβ1相互作用，而p35亚单位与IL-12Rβ2的结合则启动细胞内信号传导，包括信号转导和激活因子（STAT）4和STAT6的磷酸化。这最终增强了NK细胞的裂解活性、细胞因子的产生（包括IFN-γ）以及细胞表面分子的表达[5]。IL-23与IL-12共享p40亚单位，但具有独特的p19亚单位，通过IL-12Rβ1和IL-23R发挥作用，导致STAT3磷酸化并激活淋巴细胞。值得注意的是，IL-12p35和IL-23p19都不能独立分泌；两者都需要与p40共价连接才能实现功能性的受体相互作用和分泌[5,6]。

乌司他单抗是一种完全人源化的IgG1κ mAb，它特异性地结合IL-12和IL-23共有的p40亚单位，从而阻止它们与免疫细胞表面的IL-12Rβ1相互作用，并中和这两种细胞因子的下游生物活性[6]。这一机制解释了其在治疗中度至重度斑块型银屑病、克罗恩病和溃疡性结肠炎中的疗效和安全性[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13]。尽管IL-12/23通路在免疫相关不良事件（irAEs）中的确切作用尚不清楚，但乌司他单抗已被证明在管理如免疫相关结肠炎等irAEs方面具有超说明书用途[14]。在癌症生物学中，IL-12通过诱导IFN-γ的产生来促进抗肿瘤免疫，从而抑制肿瘤生长和转移[15],[16],[17]，而IL-23可能更多地促进肿瘤发生；因此，乌司他单抗的抗肿瘤作用可能主要通过抑制IL-23来实现[18]。

虽然许多治疗性mAb通过其Fc区域与Fcγ受体（例如NK细胞上的FcγRIIIa/CD16）或补体成分C1q相互作用，发挥抗体依赖性细胞毒性（ADCC）等效应功能，导致靶细胞通过穿孔素/颗粒酶释放而裂解[19,20]，但由于乌司他单抗通过中和细胞因子而非直接与效应细胞表面靶点结合，因此缺乏显著的ADCC活性[6,10]。ADCC过程包括：（1）mAb对靶细胞的特异性识别；（2）效应细胞上的Fc受体与抗体Fc区域的交联；（3）免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs）的磷酸化；（4）下游信号通路的激活；（5）细胞毒性颗粒的释放；（6）通过穿孔素/颗粒酶介导的坏死或凋亡消除靶细胞[20]。

在本研究中，选择U937人类单核细胞系作为乌司他单抗的靶细胞，因为其在基础条件下表面表达有限的膜结合型IL-12蛋白[21]。为了提高检测灵敏度，通过用不同浓度的IFN-γ（100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL，持续48小时）和LPS（1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.1 μg/mL，持续24小时）单独或联合刺激U937细胞来优化细胞表面IL-12的过表达。经过优化后，选择用25 ng/mL的IFN-γ刺激48小时以实现IL-12的过表达，同时保持高细胞存活率，这一点通过流式细胞术分析和台盼蓝排除法得到确认。刺激后的U937细胞作为报告系统，乌司他单抗的Fab区域与膜结合型IL-12结合。该系统被用于效应功能检测，以评估ADCC活性。

ADCC报告基因生物检测被用作替代方法来展示ADCC潜力[22]。在此检测中，靶细胞上的抗原-抗体复合物被工程化的Jurkat效应细胞识别，这些细胞稳定表达人类FcγRIIIa（CD16a）和NFAT响应性荧光素酶报告基因。人类IgG1的Fc区域与FcγRIIIa的结合激活NFAT转录因子，诱导的荧光素酶表达与ADCC的结合程度成正比。荧光素酶活性使用ONE-Step?荧光素酶检测试剂在多模式微孔板读数器上以发光模式（470 nm）进行量化（参见图1了解研究框架）[23]。曲妥珠单抗作为阳性对照，因为它已建立针对HER2表达靶点的ADCC机制，涉及通过Fc介导效应细胞（如NK细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）的招募[24],[25],[26],[27],[28],[29],[30],[31]。

尽管已知乌司他单抗可以通过中和IL-12和IL-23发挥作用而不涉及ADCC，但本研究仍结合了ADCC报告基因生物检测来生成比较数据，使用曲妥珠单抗作为已建立的阳性对照。效应细胞中的NFAT诱导程度被报告为ADCC功能的量化指标。

部分摘录

U-937细胞

U-937细胞系（悬浮细胞系）购自ATCC（CRL-1593.2），随后使用内部技术建立了主细胞库和工作细胞库。使用RPMI 1640（ATCC，30-2001）培养基准备生长介质，并添加10% FBS以在实验室中维持细胞系。所有细胞在含5% CO₂的潮湿环境中于37°C下保存。

Jurkat重组细胞

ADCC生物检测效应细胞V变体（高亲和力）—Jurkat重组细胞系，

检测U937细胞中IL-12蛋白的过表达

人类U937细胞表达少量的IL-12蛋白，该蛋白可通过RTPCR识别[21]。U937细胞以天然形式表达低水平的IL-12蛋白，不足以产生适当的反应。在IFN-γ优化研究过程中，使用了不同的浓度，具体为100 ng/mL、50 ng/mL和25 ng/mL。对于LPS，也使用了1 μg/mL、0.5 μg/mL和0.1 μg/mL的浓度来刺激U937细胞系，目的是

讨论

本研究旨在优化U937细胞系表面IL-12蛋白的过表达方法（该细胞系天然表达IL-12蛋白），使其能够作为乌司他单抗结合的靶细胞。这种方法旨在后续应用于开发ADCC报告基因检测，以说明乌司他单克隆抗体缺乏ADCC活性。在乌司他单抗的表征研究中（内部样本），

结论

本研究的目的是优化用户友好的U937细胞系的利用，该细胞系天然表达IL-12蛋白，作为乌司他单克隆抗体的靶系统。此外，研究还包括评估乌司他单抗的ADCC功能（缺乏ADCC活性），并与阳性对照曲妥珠单抗进行比较。经过优化过程后，确定48小时内所需的最低有效IFN-γ浓度为25 ng/mL。

CRediT作者贡献声明

Gandharv Singh Rawat：撰写——原始草稿、验证、资源、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Rakesh Kumar Sinha：撰写（审阅和编辑）。Jayachandran Ramalingam：调查、验证和监督。Amar Shrivastava：撰写（审阅和编辑）。Umesh Shaligram：监督和项目管理。Sunil Gairola：可视化、监督、撰写（审阅和编辑）、项目管理和资金获取。

资助

本研究未接受外部资助。

利益冲突

作者声明没有竞争利益。

致谢

我们感谢Ritesh Panchal先生、Niket Mohane先生和Atul Wavhal先生在初始检测开发方面的帮助。