《Biomaterials》：Nanoarchitectonics of penetrating peptide and anionic amphiphiles for dental plaque eradication
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口腔生物膜是引发多种口腔疾病的主要因素，而牙菌斑作为典型生物膜需高效抗菌手段清除。本研究通过将细胞穿透肽R8与四种两亲分子（SL、SDBS、AOT、NaCD）自组装，构建出多级体和纳米球等新型纳米结构。透射电镜证实R8/SL和R8/SDBS形成多层囊泡，而R8/AOT和R8/NaCD形成纳米球。ITC显示R8与两亲分子存在静电相互作用。体外实验表明所有纳米结构均具有杀菌活性，其中多层囊泡对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的膜破坏效果尤为显著。共聚焦显微成像和体外/体内实验证实，R8/SDBS多层囊泡可有效抑制生物膜形成并清除成熟牙菌斑，且展现出优异生物相容性。该研究建立了基于穿透肽与两亲分子自组装的纳米结构制备方法，为解决生物膜防护难题提供了新策略。
公学峰|王腾达|龙云子|宋刚|齐瑞莲|刘开刚|岳吉林|关博|韩玉春|王一林
中国科学院化学研究所分子科学卓越研究中心（北京国家分子科学实验室），中国北京100190
摘要
口腔生物膜是多种口腔疾病的主要原因，其中牙菌斑是典型的表现形式。开发有效的抗菌剂以清除牙菌斑是一个巨大的挑战。本文采用了一种简便的方法，即将能够穿透细胞的八精氨酸（R8）肽引入四种阴离子两亲分子——月桂酸钠（SL）、十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、双（2-乙基己基）磺基琥珀酸钠（AOT）和脱氧胆酸钠（NaCD）中，从而制备用于抗菌生物膜的纳米结构。冷冻透射电子显微镜图像清楚地显示，R8/SL和R8/SDBS形成了多层囊泡，而R8/AOT和R8/NaCD形成了纳米球。通过等温滴定量热法揭示了R8与两亲分子的结合情况。所有这些结构都表现出杀菌活性，尤其是多层囊泡具有极高的抗菌能力。值得注意的是，可以直接观察到这些囊泡对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的黏附和破坏作用。囊泡在与细菌结合后迅速分解为抗菌单元，这些单元随后破坏细菌膜。特别是共聚焦激光扫描显微镜和定量评估证明，R8/SDBS多层囊泡能有效抑制生物膜的形成并清除成熟的牙菌斑，其有效性也通过体内龋齿实验得到了验证。体内和体外实验均表明这些纳米结构具有优异的生物相容性。本研究建立了一种利用穿透肽和阴离子两亲分子构建纳米结构来清除牙菌斑和预防龋齿的有效方法。
引言
形成生物膜的病原体是人类传染病的主要致病因素之一，对公共卫生构成严重威胁[1]、[2]、[3]。牙菌斑是最常见的由生物膜介导的疾病，影响着全球人口，至今仍是一个未解决的问题[4]、[5]。牙菌斑的形成归因于细菌的定植，随后导致生物膜的形成和邻近牙釉质基质的逐渐脱矿。生物膜中的细菌被细胞外聚合物物质（EPS）所保护，这些物质形成了对抗菌剂的屏障，从而阻碍了杀菌效果[6]、[7]。传统的口腔护理抗菌剂，如氯己定和氟化物，不可避免地会导致牙齿变色或氟斑牙[8]、[9]。一些口腔抗生素在牙周感染部位的浓度较低，且难以渗透到EPS基质中，使得清除生物膜下的细菌菌落变得困难。因此，迫切需要开发新的抗菌剂来克服这些挑战，确保有效清除牙菌斑。
纳米材料的快速发展为生物医学研究的发展提供了巨大的推动力[10]、[11]，据报道多种纳米结构在应对细菌感染时表现出多维度的抗菌机制[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。值得注意的是，提高抗菌剂的渗透能力是克服生物膜复杂防御系统的关键挑战之一。能够穿透细胞的肽（CPPs）可以有效地进入细胞，并将蛋白质、肽、抗生素和其他物质传递到生物膜内部[18]、[19]、[20]。目前，受CPPs启发的抗菌策略已被广泛用于帮助进入细胞或生物膜以杀死内部细菌[21]、[22]、[23]、[24]。阳离子抗菌聚合物倾向于靶向并清除带负电荷的细菌生物膜，从而选择性地杀死细菌而非哺乳动物细胞[25]、[26]。然而，阳离子抗菌聚合物的合成通常较为复杂。近年来，超分子组装被报道为开发新型抗菌材料的有效策略[27]、[28]、[29]、[30]。阴离子两亲分子因其强大的去污能力、易生物降解性和良好的生物安全性而被广泛应用于洗涤剂产品中，但它们缺乏抗菌能力。两亲分子也是通过非共价相互作用形成超分子结构的优秀构建块，用于抗菌应用[31]、[32]、[33]。阳离子电荷和疏水基团都是与细菌膜强烈相互作用并实现渗透的重要因素[34]、[35]、[36]。因此，将阳离子CPPs与阴离子两亲分子结合被认为可以促进对生物膜的有针对性的破坏和增强渗透，从而消灭隐藏在这些保护性基质中的细菌。
最近，我们发现阴离子两亲分子十二烷基苯磺酸钠（SDS）和八精氨酸（R8）可以通过结合阳离子电荷和疏水特性形成层状结构，对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表现出优异的抗菌活性[37]。我们进一步选择了四种结构不同的阴离子两亲分子，包括线性月桂酸钠（SL）和十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、支链双（2-乙基己基）磺基琥珀酸钠（AOT）以及面状两亲分子脱氧胆酸钠（NaCD），通过与R8共组装来构建抗菌纳米结构（图1）。这四种阴离子两亲分子含有不同的疏水域和磺酸基团或羧酸基团。SL是一种主要从天然椰子油甘油三酯合成的阴离子两亲分子，可以干扰细菌细胞膜的脂质结构[38]。SDBS是一种在日常化学产品中广泛使用的两亲分子，其疏水苯环的存在增强了其与脂质双层的结合能力[39]，有利于提高杀菌效果。AOT具有双链结构，与单链对应物相比，其与细菌膜的疏水相互作用更强。此外，支链结构通过空间位阻效应有助于提高膜的通透性[40]。NaCD作为一种胆汁酸衍生物，具有显著的生物相容性[41]、[42]，其面状两亲性质使其能够增强膜的通透性或破坏细菌细胞壁的完整性[43]、[44]、[45]、[46]。R8是一种跨膜肽，其正电荷有利于细胞渗透。R8还与阴离子两亲分子具有高亲和力，因此推测R8可以与选定的两亲分子形成纳米组装体，并触发高效的膜破坏活性。结果表明，R8/SL和R8/SDBS形成了多层囊泡，而R8/AOT和R8/NaCD形成了纳米球，如图1所示。这些纳米结构表现出优异的杀菌活性和生物相容性。特别是牙菌斑模型和体内龋齿实验证实了多层囊泡对成熟变形链球菌（Streptococcus mutans）生物膜的清除效果。
章节片段
相互作用和共组装纳米结构
通过等温滴定量热法（ITC）技术表征了能够穿透细胞的肽R8与阴离子两亲分子（SL、SDBS、AOT和NaCD）之间的热力学相互作用。图1a1-a4和b显示了原始热流曲线及其对应的积分焓曲线。显然，R8与SL或NaCD的相互作用呈现两阶段结合过程。最初将SL或NaCD溶液滴加到R8溶液中会触发阴离子羧基团的静电结合结论
总之，这些纳米结构是由一种生物相容的能够穿透细胞的肽与几种阴离子两亲分子自组装而成的，表现出强大的抗菌和抗生物膜能力。抗菌活性来源于能够穿透细胞的肽中的阳离子电荷和两亲分子中的疏水基团的协同作用。冷冻透射电子显微镜观察到的抗菌机制表明，聚集体首先结合
材料
月桂酸钠（SL，>98%）、十二烷基苯磺酸钠（SDBS，>95%）、双（2-乙基己基）磺基琥珀酸钠（AOT，>99%）和脱氧胆酸钠（NaCD，>99%）购自Sigma-Aldrich。肽R8由GL Biochem有限公司（中国上海）提供，肽水溶液的pH值调整至7.0以进行后续实验。活/死细菌活力双染色试剂盒购自MIKio（中国上海）。革兰氏阴性细菌大肠杆菌（Escherichia coli）CRediT作者贡献声明
王一林：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、数据分析、概念构思。公学峰：撰写——初稿、方法学、数据分析、概念构思。齐瑞莲：方法学。宋刚：方法学。龙云子：方法学。王腾达：方法学。韩玉春：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、数据分析、概念构思。关博：方法学。岳吉林：方法学。刘开刚：方法学利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢
本研究得到了国家自然科学基金（21988102、22072161、22272184）和中华人民共和国 Ministry of the People's Republic of China（2021YFA0716700）的财政支持。
