《Biomaterials》：Leveraging Self-Healing CASH Gel for Enhanced Paracrine Secretion of Mesenchymal Stem Cells to Boost Endometrial Regeneration
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本研究开发了一种基于明胶的复合自愈水凝胶（CASH），通过剪切稀化和自愈特性实现微创递送，模拟细胞外基质（ECM）微环境以增强间充质干细胞（MSCs）的存活与功能。实验证实CASH凝胶通过激活PI3K信号通路促进MSCs旁分泌效应，协同免疫重塑、纤维化逆转、血管再生和子宫内膜再生，有效治疗子宫内粘连（IUA），恢复生育能力。
邵飞|安传峰|薛启民|肖云云|王启凡|王书亚|杨雪颖|潘晨曦|王丽斌|于晓川|张永刚|方成|王华莉|王焕南
中国辽宁省大连市大连工业大学生物工程学院生物智能制造教育部重点实验室，邮编116024
摘要
最近的研究表明，局部输送间充质干细胞（MSCs）在治疗子宫内膜粘连（IUA）方面取得了成功，这得益于MSCs的免疫调节、促血管生成和抗纤维化特性，这些特性有助于子宫内膜再生并恢复子宫功能。然而，这些供体细胞直接暴露在子宫腔内的有害病理微环境中，不可避免地导致细胞存活率降低、细胞命运控制不佳以及细胞功能受损，从而显著影响治疗效果。本文提出了一种基于明胶的胶体组装自愈（CASH）水凝胶，用于将供体MSCs局部输送并保留在子宫腔内。CASH凝胶的剪切变稀和自愈特性使其能够实现微创植入，并作为模拟细胞外基质（ECM）的支架，以适应复杂的子宫腔内环境。重要的是，CASH凝胶支持MSCs在三维环境中的黏附和增殖。我们发现，CASH凝胶通过PI3K信号通路增强MSCs的旁分泌活性，从而通过免疫重塑、纤维化降解、血管重塑和子宫内膜再生等多重策略逆转IUA并提高生育能力。总体而言，本研究为通过细胞-材料相互作用提高MSCs的治疗效果提供了重要见解，为设计先进的IUA干细胞疗法提供了有前景且简单的策略。
引言
子宫内膜粘连（IUA）是难治性不孕的常见原因。它源于机械性创伤或感染，这些因素会损伤基底子宫内膜层。这种损伤直接导致子宫内膜结构缺陷和子宫壁灌注不足，引发长期炎症。炎症反应使子宫内膜修复转向非再生性纤维化修复过程，其中纤维结缔组织逐渐取代了原有的子宫内膜。最终，这一过程可能导致子宫腔部分或完全闭塞[1]，[2]。目前的标准临床治疗方法主要是宫腔镜粘连松解术[3]，结合术后雌激素治疗[4]，[5]。另一种IUA治疗方法是引入生物材料植入物，以占据子宫腔体积并物理阻止再生子宫内膜的再粘连[6]，[7]。尽管这些方法可以在一定程度上恢复子宫腔的解剖完整性，但它们无法逆转子宫内膜的功能障碍或纠正创伤或感染后的局部炎症-纤维化病理级联反应，因此无法有效治疗IUA，甚至可能导致生育能力丧失[8]。为了克服这些限制，有必要超越传统的物理屏障策略，转而激活内源性再生过程。因此，提出了包括干细胞固定植入、血管网络重塑和免疫微环境重编程在内的疗法[1]，这些方法已被证明能够协调调节子宫内膜功能恢复和生育能力。
其中，间充质干细胞（MSCs）疗法在再生医学中显示出巨大潜力，因为它们在免疫调节和促再生功能方面发挥着重要作用。最新进展强调了干细胞输送在IUA治疗中的治疗潜力，通过免疫调节纤维化子宫内膜[3]，[9]，[10]。研究表明，MSCs分泌旁分泌因子，抑制慢性子宫内膜炎症[11]，[12]，[13]，减缓纤维化进程，刺激子宫内膜上皮增殖[14]，并恢复腺体功能[15]，表明其具有治疗IUA的潜力[15]，[16]，[17]。然而，移植的MSCs面临一个主要障碍：受损的子宫内膜形成了一个充满缺氧、缺血和营养匮乏的恶劣微环境。此外，宿主免疫系统的清除作用对细胞植入构成重大阻碍，而缺乏固定载体会导致细胞从损伤部位迅速分散，从而削弱局部再生能力。无论采用全身还是局部给药方式，这些不利条件都会降低移植MSCs的存活时间和活力[18]。因此，使用生物材料作为输送载体和人工基质，以提供免疫保护[15]，[19]以及模拟微环境[19]，最近受到了越来越多的关注，以提高干细胞治疗IUA的效果。
为此，开发了具有微米级孔隙率的支架[8]，[20]，[21]，[22]，[23]，[24]或纳米级网眼的水凝胶[10]，[25]，[26]，[27]等载体，用于固定或捕获干细胞，以实现子宫内膜的局部再生。例如胶原海绵[20]，[21]，[24]，羊膜[8]或聚乳酸（PLA）和癸酸甘油酯（PGS）制成的聚合物支架[22]等，已被用于植入供体MSCs并将其输送到子宫腔内。然而，这些生物材料[22]存在以下问题：i) 无法适应子宫腔的复杂形状；ii) 刚性支架与柔软的子宫组织之间的机械信号不匹配；iii) 需要侵入性植入和二次手术来移除支架[21]。相比之下，可注射水凝胶作为细胞载体，可以实现微创输送，更好地满足IUA局部干细胞治疗的需求[10]，[28]，[29]，[30]。为此，前体具有流动性，可以在输送过程中直接与细胞混合的水凝胶被广泛使用，通过自由基聚合[31]、席夫碱反应[32]或迈克尔加成反应[10]等触发聚合方案实现原位凝胶化/固化。然而，这些水凝胶的合成过程复杂，需要使用化学催化剂或引发剂来引发聚合，且可能存在细胞毒性降解副产物[33]，[34]。此外，大多数共价交联的水凝胶弹性较高，无法物理适应子宫内的局部运动或剪切力，也无法提供模拟机械转导信号来调节细胞功能和促进子宫内膜修复。
由可逆键形成的水凝胶[35]最近成为细胞输送和组织工程的理想生物材料。这些水凝胶具有剪切变稀和自愈行为、可注射性和可塑性[36]、适应局部不规则腔体形状的能力[37]、模拟ECM的粘弹性[38]，甚至具有组织黏附能力[39]，在驱动功能性组织再生方面表现出色。这些可逆交联凝胶在制备简便性、持续细胞固定和输送方面具有巨大潜力，同时作为模拟ECM的生物基质，通过增强免疫调节功能和基质重塑活性来提高干细胞治疗效果。在这些水凝胶中，基于纳米颗粒通过物理相互作用（如静电、疏水或氢键）自下而上组装的胶体凝胶显示出优于传统聚合物凝胶的性能。这些胶体组装凝胶具有类似聚合物凝胶的自愈行为，但机械强度范围更广[40]，由于颗粒构建块的容易重组而具有更快的愈合效率，以及更好的可注射性、可打印性和形状保真度[36]，[41]。更重要的是，颗粒设计简化了药物装载程序和操作流程，使其成为持续药物释放的理想输送载体[42]，[43]，[44]。此外，它们还具有强大的微纳米多孔网络，比传统聚合物凝胶更有效地促进物质传递[45]。这些特性使胶体组装自愈（CASH）凝胶成为局部细胞输送的理想选择，支持正常的细胞活力和功能[38]，[41]。尽管CASH凝胶具有这些优势，但其用于IUA治疗的封装干细胞输送潜力仍需进一步阐明。此外，CASH凝胶调节干细胞行为的潜在机制尚未探索，需要进一步澄清。
我们开发了一种基于生物材料的干细胞疗法，利用触变CASH凝胶载体捕获MSCs，显示出显著的治疗效果，能够促进子宫内膜再生和生育能力恢复。具体来说，CASH凝胶的触变性使其具有剪切变稀和自愈特性，便于微创注入子宫腔，形成组织保护屏障以防止粘连。此外，CASH凝胶为细胞提供了对抗子宫内局部炎症和机械应力的机械保护，并通过增强干细胞的旁分泌作用，作为细胞因子和生物活性介质的储存库。生长因子和免疫调节信号的持续释放有效纠正了炎症微环境，逆转了IUA动物模型中的不希望出现的纤维化和子宫内膜再粘连。进一步的研究表明，CASH封装重新配置了MSCs的旁分泌因子，通过激活PI3K信号通路促进了血管生成和基质重塑。总体而言，这一创新的基于水凝胶的平台通过精确输送MSCs，实现了免疫调节、纤维化逆转和功能性子宫内膜再生，为克服IUA的自我延续病理机制提供了变革性解决方案。
节选
触变CASH凝胶可实现微创细胞输送并在子宫腔内长时间驻留
理想的细胞输送和长期驻留子宫腔的载体应满足以下条件：i) 能够方便地装载和输送细胞，最好是非侵入性或微创方式；ii) 能够适应子宫腔内的复杂形状和持续剪切应力；iii) 能够模拟体内生化 and 生物力学环境信号，以支持细胞活力和功能。基于这些要求，我们
讨论
间充质干细胞（MSC）疗法已成为治疗子宫内膜粘连（IUA）的有前景的方法，在子宫内膜修复和子宫腔微环境调节方面显示出临床前疗效。然而，临床转化面临重大挑战：(1) 由于“击中即跑”[65]机制——细胞在治疗部位停留时间较短，仅与微环境短暂相互作用。
结论
我们开发了一种新型可注射胶体凝胶，具有内在的可降解性、自组装能力和自愈特性，用于子宫内干细胞输送。该系统在损伤部位提供机械保护，并作为干细胞保留和持续释放旁分泌因子的生物活性支架。实验验证表明，这种胶体凝胶显著增强了MSCs的旁分泌信号，有效调节了病理过程
材料
CASH凝胶的前体粉末由Huanova Biotech（中国深圳）生产。Huanova Biotech采用先前描述的脱溶技术[36]制备了CASH凝胶的前体粉末。分别制备了CASH 1凝胶（50mg/ml）、CASH 2凝胶（80mg/ml）和CASH 3凝胶（100mg/ml），方法是将CASH凝胶的前体粉末与α-MEM混合。透明质酸（HA）水凝胶（BioRegen，中国）、最小必需培养基α（α-MEM，Cytiva，中国）、DMEM/F12培养基
CRediT作者贡献声明
邵飞：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。王书亚：方法学、数据分析。杨雪颖：方法学、数据分析。潘晨曦：方法学、数据分析。王丽斌：方法学、数据分析。安传峰：撰写——原始草稿、数据分析。薛启民：方法学、研究、数据分析。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了
中国中央高校基础研究基金（编号：DUT23YG221、大连科技创新基金会（2022JJ13SN086）的支持。图5中的插图由
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