黄芪（Huangqi）和当归（Danggui）的联用通过抑制NOX4介导的ROS（活性氧）积累来防止大鼠的脑缺血/再灌注损伤，从而抑制细胞焦亡（pyroptosis）的发生

黄芪当归通过抑制NOX4介导的ROS积累减轻脑缺血再灌注损伤。实验显示HQDG改善神经功能、脑血流，减少病理损伤及吡罗妥osis相关指标，其机制与NOX4-ROS通路抑制相关。

　　

作者：柴成轩、刘璐瑶、王瑞坤、袁丽荣、侯贤明、赵伟、杜淑珍、卢文静、袁新欣、常亮、张毅

中国石家庄，河北中医薬大学，邮编050200

摘要

背景

缺血-再灌注（I/R）损伤是缺血性中风（IS）预后不良的关键因素，目前缺乏有效的神经保护剂。补阳还五汤（BYHWD）作为一种经典的中药疗法，被广泛认为是治疗IS的有效方法，其主要活性成分是黄芪-当归（HQDG）。初步研究表明，HQDG可以减轻脑部的I/R损伤，但其作用机制尚不明确。

材料与方法

建立了大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型。通过Western blot和流式细胞术检测正常脑组织、缺血核心区和半影区的NADPH氧化酶4（NOX4）和活性氧（ROS）水平。通过神经功能评分、HE染色、脑血流监测、免疫荧光和Western blot等方法评估HQDG对神经功能缺陷和神经元凋亡（pyroptosis）的影响。利用腺相关病毒（AAV）介导的NOX4过表达来验证这一机制，并结合TTC染色、透射电子显微镜和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行验证。

结果

在MCAO/R大鼠的缺血半影区，NOX4和ROS的表达水平显著升高。HQDG不仅显著改善了神经功能，恢复了脑血流，并减轻了脑部病理损伤，还降低了与凋亡相关的指标。XST也能改善模型大鼠的神经功能，减轻脑部病理损伤，并抑制脑组织细胞的凋亡，但其效果不如HQDG明显。为了进一步阐明NOX4的机制，我们分别通过AAV介导的NOX4过表达和Apocynin进行了靶向激活和抑制实验。结果表明，AAV组逆转了HQDG对ROS生成和凋亡的抑制作用，反而加剧了神经元和脑部的病理损伤。相反，Apocynin再现了HQDG的神经保护作用，通过抑制NOX4驱动的ROS和凋亡来减轻I/R损伤。

结论

HQDG通过抑制凋亡来缓解脑部I/R损伤，这一作用是通过抑制NOX4介导的ROS积累实现的。

引言

随着全球老龄化进程的加速，神经系统疾病已成为全球主要的疾病原因。中风不仅是这些疾病中最常见的，而且预后最差（2024年数据）。此外，中风的发病率和死亡率每年都在上升，研究人员估计到2050年，全球每年因中风死亡的人数将接近1000万（Feigin和Owolabi，2023年）。中风在临床上分为缺血性和出血性两种类型，其中缺血性中风约占所有中风的80%（Fu等人，2024年）。及时的临床干预是治疗缺血性中风的关键，包括机械取栓术和静脉溶栓治疗，这些方法有助于恢复脑部血管的通畅（Nam和Kim，2023年）。然而，恢复血液灌注可能会加重脑组织损伤，这种现象称为脑缺血-再灌注（I/R）损伤。尽管抗凝治疗在临床中得到广泛应用，但针对I/R损伤的药物治疗方案仍然不足（Kleindorfer等人，2021年）。 脑部I/R损伤是一个复杂的病理生理过程，涉及氧化应激、炎症反应、细胞内钙平衡失调和能量紊乱，这些因素相互影响、交织在一起，最终导致大量神经细胞死亡和脑组织损伤（Gong等人，2017年；Wang等人，2023年）。因此，开发有效的治疗策略以缓解脑部I/R损伤仍然是一个未解决的挑战，近年来研究人员越来越重视炎症过程在介导脑部I/R损伤中的作用（图1）。 凋亡是一种与炎症密切相关的细胞死亡类型，研究表明凋亡在脑部I/R损伤中起着关键作用（Li等人，2023年）。在脑部I/R损伤发生后，受损脑组织中的线粒体会迅速产生大量活性氧（ROS），ROS的积累被认为是经典凋亡的主要驱动因素（Devant等人，2023年）。NADPH氧化酶4（NOX4）是内源性ROS的主要来源之一（Fang等人，2021年），而NOX的主要亚型之一NOX4在中枢神经系统中广泛表达（Cooney等人，2013年）。研究表明，NOX4水平的升高会导致脑组织中ROS的产生增加（Park等人，2021年）。因此，我们认为NOX4可能通过在中脑I/R损伤期间介导ROS积累来影响凋亡（图2）。 在过去十年中，越来越多的学者开始关注将中医（TCM）应用于脑缺血领域（Liu等人，2021年；Zhou等人，2024年）。作为著名的经典中药方剂，补阳还五汤（BYHWD）对IS具有显著的治疗效果（Wang等人，2022年）。我们的团队一直致力于研究BYHWD治疗中风的基本机制（Yin等人，2023年；Zhao等人，2021年）。根据中医理论，黄芪（Astragalus membranaceus）是BYHWD中的君药，当归（Angelica sinensis）是臣药。这两种药材的独特配比和用量构成了该方剂临床效果的基础。此外，黄芪和当归组成的HQDG相比BYHWD具有更简单的成分结构，有利于研究它们在治疗疾病中的具体作用机制。因此，HQDG在治疗IS中的疗效和机制值得进一步研究（图3）。 先前的研究表明，HQDG会影响IS过程中的凋亡，并且发现BYHWD可以通过下调NOX4来减少IS后的ROS生成。基于此，我们进行了一系列实验，以探讨HQDG是否通过调节NOX4介导的ROS积累来抑制凋亡，从而减轻脑部I/R损伤。

实验动物

从辽宁长盛生物技术有限公司购买了7周龄（260～280克）的雄性无特定病原体（SPF）Sprague-Dawley（SD）大鼠[SCXK(Liao)2020–0001]。所有动物在建立模型前都经过了一周的适应期。本实验获得了河北中医薬大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号：DWLL202309004）。

实验药物

HQDG由两种药材组成：Astragalus membranaceus和Angelica sinensis

第一部分：MCAO/R大鼠正常脑组织、缺血核心区和缺血半影区中NOX4和ROS水平的差异

为了研究脑部I/R损伤对脑组织中NOX4和ROS水平的影响，我们使用Western blot和流式细胞术观察了MCAO/R大鼠不同脑组织区域的NOX4和ROS初始差异。Western blot结果显示，在脑缺血和再灌注3天后，缺血半影区的脑组织中NOX4的表达量显著高于正常脑皮层和缺血核心区（图4A）。流式细胞术结果也表明...

讨论

由于发病率、致残率和死亡率较高，IS被认为是一个严重的公共卫生问题（2024年数据）。由于该疾病的复杂发病机制，目前仍缺乏有效的神经保护剂。炎症细胞坏死（即凋亡）表现为细胞持续扩张直至膜破裂，释放大量促炎因子，从而引发强烈的炎症反应（...

结论

总体而言，我们观察到HQDG在体内能够减轻脑部I/R损伤。NOX4介导的ROS积累导致的广泛神经元凋亡可能是脑部I/R损伤的重要病理机制。HQDG通过抑制NOX4介导的ROS积累来保护神经元。这些发现为基于传统中药的IS疗法及其相关治疗机制的研究奠定了基础...

作者贡献声明

柴成轩：撰写原始稿件、数据可视化、方法设计、数据管理。 刘璐瑶：撰写原始稿件、数据可视化、方法设计、数据管理。 王瑞坤：撰写原始稿件、数据可视化、方法设计、数据管理。 袁丽荣：监督研究、概念构思。 侯贤明：监督研究、概念构思。 赵伟：监督研究、资金筹集、概念构思。 杜淑珍：监督研究、资金筹集、概念构思。 卢文静：软件应用、格式处理。

资助

本研究的资金来自：国家自然科学基金（项目编号82104963）、河北省中医药科学研究计划（2024336）、河北省高等教育科学研究项目（QN2025117）、河北省高等教育机构科学研究项目（QN2022069）以及河北省卫生健康委员会医学科学研究计划（20211106）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。