《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Genome-wide analysis and expression profile of the thioester-containing proteins (TEP) in
Micropterus salmoides
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硫酯蛋白基因家族在感染中的可变剪接调控机制及其进化分析。大口黑鲈基因组中共鉴定21个TEP基因，包括7个A2M、5个C3、4个C4等，发现MsA2ML1、MsC3和MsC4存在大量非同义单核苷酸多态性。感染后As分析显示18号外显子可变剪接显著上调，证实硫酯蛋白通过可变剪接实现免疫应答调控。
陈玉平|姜梦珍|唐胜梅|鲜亚玲|文嘉怡|邹泽成|王永生
中国农业科学院佛山现代农业研究所昆鹏现代农业研究院，深圳，518000
摘要 含硫酯蛋白（TEPs）在生物和非生物胁迫的先天免疫反应中起着至关重要的作用。然而，目前尚缺乏对Micropterus salmoides （M. salmoides ）中TEP 基因家族的全面基因组范围鉴定和表达分析。在本研究中，我们在M. salmoides 的基因组中鉴定了21个TEP 基因，其中包括A2M的7个拷贝、CD109的2个拷贝、C3的5个拷贝、C4的4个拷贝，以及C5、A2ML1和CPAMD8的各1个拷贝。功能分析和进化关系表明，这些基因与其他硬骨鱼类的TEPs具有高度同源性。转录序列变异分析发现TEP基因转录本中存在大量非同义单核苷酸变异（nsSNVs），其中MsA2ML1 、MsC3 和MsC4 受影响最为显著。尽管这些变异可能反映了基因组多样性，但仍需进一步验证以区分真正的多态性与转录或技术伪影。可变剪接（AS）分析揭示了M. salmoides 中TEPs的多个剪接位点和事件。差异性可变剪接（DAS）分析显示，在感染Aeromonas 后MsA2ML1 变异显著增加。通过对基因结构及多序列比对的分析，发现这些变异是由第18外显子的剪接产生的。转录组定量和qRT-PCR验证证实了TEP 基因在M. salmoides 中对Aeromonas 感染的响应性。我们的研究首次全面描述了大口黑鲈中的TEPs谱系，并揭示了感染诱导的剪接作为硬骨鱼类先天免疫机制中的新调控层次。
引言 含硫酯蛋白（TEPs）是先天免疫系统中进化保守的成分，在不同动物谱系中发挥着关键的病原体识别和清除作用（Christophides等人，2002年；Buresova等人，2011年）。它们的标志性结构特征是在保守的GCGEQ基序中半胱氨酸侧链与相邻谷氨酸之间形成的链内硫酯（TE）键（Dodds和Law，1998年）。当受到蛋白酶切割、高温或水环境等刺激激活时，该键会暂时暴露并变得高度反应性（Salvesen等人，1981年；Sahu等人，1994年）。一旦激活，TE基序可以共价结合到生物表面的羟基或氨基上，包括病原体表面的这些基团，从而标记非自身物质以供免疫系统清除（Dodds等人，1996年）。TEP超家族主要包括三个主要组：（1）α2-巨球蛋白 （A2Ms），（2）补体成分C3、C4和C5，以及（3）主要存在于无脊椎动物中的严格意义上的TEPs（Blandin和Levashina，2004年）。根据结构组织、结构域架构和作用机制，TEPs大致分为两个亚家族：补体因子和A2Ms。真后生动物的系统发育研究表明，C3亚家族（包括C3、C4及其同源物）与A2M亚家族（包括A2M、PZP、CD109、CPAMD8及无脊椎动物TEPs或iTEPs）之间存在二分化的进化分支（Fujito等人，2010年；Nonaka，2011年）。
在脊椎动物的补体系统中，C3和C4作为中心调理素，通过其TE键与微生物表面共价结合，并通过与免疫细胞上的补体受体（CRs）相互作用促进吞噬清除（Law和Levine，1977年；Dempsey等人，1996年）。虽然C5在结构上与C3和C4相关，但它缺乏硫酯基序，而是在补体级联反应的下游发挥作用，通过生成强效的过敏毒素C5a并启动膜攻击复合体（MAC）的形成（Shokal和Eleftherianos，2017年）。当被目标蛋白酶切割时，A2M会发生构象变化，通过TE键与酶共价结合，有效中和其活性。与A2M密切相关的PZP具有相似的结构和功能。另一种类似A2M的蛋白质CD109已被证明可以通过结合TGF-β受体I来调节人类角质形成细胞的TGF-β信号传导，尽管其硫酯键在此过程中的具体作用尚不清楚（Finnson等人，2006年）。CPAMD8是一种细胞相关蛋白，结合了补体和A2M蛋白的结构元素，具有功能性丝氨酸蛋白酶和硫酯结构域，表明其在蛋白酶调节和炎症反应中的作用（Li等人，2004年）。尽管某些人类TEPs的功能已经明确，但TEP家族的更广泛系统发育关系和进化轨迹仍不清楚。尽管C3/C4/C5与A2M/PZP之间存在明确的同源关系，但TEPs的功能多样化和谱系特异性扩展，特别是在无脊椎动物中，仍需进一步研究。
Micropterus salmoides （M. salmoides ），通常被称为大口黑鲈，是一种原产于北美湖泊和溪流的肉食性淡水鱼。由于其快速生长、环境适应性、疾病抵抗力以及高蛋白含量和无肌间骨的特点，它已成为一种高价值的水产养殖物种。2023年，中国的产量达到了888,000吨（Zhang等人，2024年）。这种持续的增长凸显了它在中国淡水养殖产业中的核心地位。然而，集约化的养殖方式导致了水质下降和传染病的易感性增加，对产业可持续性构成了重大威胁（Godahewa等人，2018年；Samsing等人，2020年）。大口黑鲈易受多种病原体感染，包括寄生虫、细菌和病毒。其中，Aeromonas hydrophila （A. hydrophila ）是一种普遍存在于水生环境中的革兰氏阴性细菌，尤其值得关注。它能够感染多种宿主，并单独或与其他病原体协同作用，引起严重的疾病，如细菌性肠炎、腹水和运动性Aeromonas 败血症，常常导致大量死亡和巨大的经济损失（Basri等人，2020年；Guo等人，2019年；Kali等人，2016年；Zhao等人，2018年；Gao等人，2013年）。
尽管大口黑鲈具有重要的经济价值，但其宿主-病原体相互作用，特别是对A. hydrophila 和其他病原体的免疫反应的分子机制仍知之甚少（Zhou等人，2021年）。阐明这些机制对于开发针对性的疾病控制策略和确保大口黑鲈养殖的长期可持续性至关重要。尽管含硫酯蛋白在先天免疫中起着重要作用，但它们在大口黑鲈对A. hydrophila 感染反应中的作用仍不甚清楚。在本研究中，我们鉴定了大口黑鲈基因组中的六个TEP家族成员：C3、C4、C5、A2M、CD109和CPAMD8，并分析了它们在A. hydrophila感染后的表达动态。此外，我们还进行了转录序列变异、结构域架构、进化关系和差异性可变剪接（DAS）的综合分析，以阐明这些TEPs的进化轨迹和潜在的免疫功能。
TEP的鉴定与分类 为了鉴定
M. salmoides （登录号：GCF_014851395.1）和
M. dolomieu （登录号：GCF_021292245.1）中的
TEP 基因，我们从NCBI数据库获取了这两个物种的全基因组序列（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）。此外，还从NCBI检索了
Danio rerio 、
Dicentrarchus labrax 、
Siniperca chuatsi 、
Mus musculus 和
Homo sapiens 的TEP同源物的氨基酸序列，用作BLASTP分析的查询序列（E值<1?×?e
?5 ）。同时使用了隐马尔可夫模型（HMM）进行分析。
TEP的鉴定与分类 在M. salmoides 和M. dolomieu 的基因组中总共鉴定了21个TEP 基因（表1）。这两种物种中的TEPs组成和分布有所不同。M. salmoides中鉴定出以下TEP 基因：A2M的7个拷贝、CD109的2个拷贝、C3的5个拷贝、C4的4个拷贝，以及C5、A2ML1和CPAMD8的各1个拷贝。相比之下，M. dolomieu中含有A2M的6个拷贝、CD109的2个拷贝、C3的7个拷贝、C4的3个拷贝
讨论 TEPs是模式识别受体，有助于先天免疫并抵御入侵的病原体（Blandin和Levashina，2004年）。越来越多的证据表明，TEPs存在于无脊椎动物中并在先天免疫中发挥关键作用（Ma等人，2010年；Liao等人，2018年；Ning等人，2019年；Wang等人，2021年）。如前所述，不同物种拥有不同数量的TEPs。例如，
Drosophila有6个，Anopheles gambiae 有15个，Aedes aegypti 结论 在本研究中，我们系统地鉴定了M. salmoides中的21种含硫酯蛋白，并揭示了它们的进化保守性和多样性。MsC3 和MsA2M 家族经历了显著的扩张，而MsC5仍为单拷贝、高度保守的基因，表明TEP成员在免疫防御中的功能存在差异。感染实验显示MsC3 、MsC4 和MsC5 具有组织和时间特异性的表达模式，突显了它们的核心作用
CRediT作者贡献声明 陈玉平： 撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，方法学，研究，概念化。姜梦珍： 方法学，研究，正式分析。唐胜梅： 方法学，研究，正式分析。鲜亚玲： 方法学，研究，正式分析。文嘉怡： 方法学，研究，正式分析。邹泽成： 方法学，研究，正式分析。王永生： 撰写——审阅与编辑，监督，项目管理。
利益冲突声明 作者声明他们没有可能影响本研究报告工作的财务利益或个人关系。
致谢 本工作得到了佛山现代农业研究所昆鹏现代农业研究院首席研究员科学研究基金 （KIMAQD2022002）和佛山现代农业研究院重大科学研究任务资助 （KIMAZDKY2022003）的支持。
