综述：单价离子有助于促进两种金属离子依赖的RNA编辑酶的催化作用

《Coordination Chemistry Reviews》：Monovalent ions aid catalysis of two-metal-ion dependent RNA editors

二价离子催化、一价离子协同作用、RNA切割机制、过渡态稳定、计算模拟。

　　

Jure Bori?ek|Jana Aupi?|Alessandra Magistrato

斯洛文尼亚卢布尔雅那1001，国家化学研究所理论部

摘要

核酸中磷酸二酯键的断裂和形成由多种细胞机制完成，这些机制从小型蛋白质酶到由蛋白质和/或RNA链组成的大型复合体不等。长期以来，人们认为这些过程仅依赖于双金属离子机制，但比较结构分析表明，某些复合体还含有高度保守的第二壳层单价阳离子。双Mg²⁺辅助的催化机制已被广泛证实：这两种离子都作为路易斯酸发挥作用，其中一个金属活化亲核试剂（水或核糖羟基）以攻击可切割的磷酸基团，另一个金属则稳定离去基团。相比之下，单价离子的功能长期以来被忽视了，导致在不同催化环境中的结果存在差异。然而，最新证据表明，单价离子在RNA折叠和组装之外的催化过程中也起着重要作用。本文基于对双金属离子依赖性核酶的最新计算研究，展示了二价和单价离子如何精细调节催化位点的排列和动态，从而影响RNA断裂反应的动力学和热力学性质。我们讨论了根据亲核试剂类型优化的催化机制，并阐明了第二壳层单价离子为优化催化几何结构所采用的策略，这种优化有助于实现从亲核试剂到离去基团的有效质子转移，这是高效催化的关键。这篇综述扩展了对核酸处理机制的理解，为设计创新的基因调控工具和治疗策略提供了关键知识。

引言

核酸的处理是分子生物学的基石，包括DNA复制和修复、RNA转录、剪接、翻译和降解等基本反应[1]。这些涉及磷酸二酯键断裂和形成的反应由多种酶催化，包括基于蛋白质的聚合酶和核酸酶，以及基于RNA的核酶和蛋白质/RNA结合的核糖核蛋白（RNPs）。这些进化上不同的机制的一个显著特征是它们都依赖于二价金属离子作为必需的催化辅因子[2]、[3]。

1993年，Steitz和Steitz提出了一个统一的机制框架，提出了一个通用的双金属离子机制用于磷酸转移反应[4]。该模型认为，两个二价金属离子（通常是Mg²⁺）位于活性位点，协调催化过程：一个离子（M1）降低亲核试剂（水分子或（脱氧）核糖羟基）的pKa值，而另一个离子（M2）稳定五价磷杂环过渡态和离去基团上的负电荷[4]、[5]。这一优雅而有力的假设为许多核酸处理酶的金属依赖性提供了化学解释，并预测核酶将采用与其蛋白质对应物类似的催化机制。

随后几十年的结构和生化研究证实了这一模型。双金属离子催化核心首次在不同DNA和RNA聚合酶、RNase H以及外切和内切核酸酶的活性位点中被可视化[6]、[7]。2005年，I型自剪接内含子的晶体结构提供了首个直接证据，证明核酶中也存在双金属离子催化中心，支持了这一进化趋同的预测[8]。此后，这一特征在其他核酶的活性位点也被发现，包括在细菌中催化前mRNA剪接的II型内含子[9]、工程化的聚合酶核酶[10]，以及在真核生物中催化前mRNA剪接的大型蛋白质导向核酶（如剪接体）[11]、[12]、[13]、催化前体tRNA（pre-tRNA）5′端成熟的核糖核酸酶P[14]，以及处理前核糖体RNA的核糖核酸酶MRP[15]。

这些（核）酶的活性位点带有强烈的负电荷，额外的金属离子和/或碱性氨基酸残基被认为有助于减少磷酸骨架的静电排斥[16]。因此，虽然已知K⁺和Na⁺对大型RNA的折叠和结构稳定性至关重要[11]、[17]，但它们通常被认为是没有特定催化功能的背景电解质[18]、[19]。

尽管双金属离子模型取得了成功，但最近的研究表明它可能无法完全捕捉核酸处理机制的复杂性[20]、[21]。对核糖体晶体结构的重新评估突显了单价离子在大型RNA中的普遍性和特异性结合[22]。此外，结构研究表明单价离子在核酶中的重要性[16]。最近，冷冻电镜（cryo-EM）[20]和计算[23]研究证明，在剪接体活性位点的两个催化Mg²⁺离子附近存在一个保守且功能关键的K⁺离子。这一发现表明，经典的双金属离子机制可以通过第二壳层单价阳离子得到增强，后者积极参与催化过程。

理解二价和单价离子之间的协同作用是一个挑战。它们的化学性质不同：Mg²⁺是一种小而强的路易斯酸，倾向于特定的内球协调；而K⁺则是一种较大、较软的离子，具有更灵活的协调能力，这表明它们扮演互补的角色。阐明这种复杂的离子效应对于全面理解RNA处理过程至关重要。然而，在RNA结构中精确分配二价和单价离子仍然具有挑战性[22]。

在这篇综述中，我们探讨了依赖双金属离子的RNA处理机制的催化机制，特别关注多金属离子框架。首先回顾了计算方法和经典双金属离子机制及其变体的核心原理，随后介绍了单价离子在催化中的具体作用。在整个过程中，我们基于这些离子的综合效应提供了通用的机制考虑和指导原则。

计算模拟方法

计算方法，特别是全原子经典分子动力学（MD）和混合量子力学/分子力学（QM/MM）模拟，能够以亚原子细节研究反应机制[24]，因此成为细化金属中心组成、几何结构和动态以及解析这些复杂系统机制的宝贵工具[13]、[25]、[26]。

经典MD模拟是最常用的技术，用于研究

双金属离子机制：核心原理

双金属离子机制为催化磷酸转移反应提供了一种稳健且多用途的策略[4]，由于阴离子磷酸骨架与进入的亲核试剂之间的静电排斥作用，这一过程在化学上具有挑战性[42]。这种反应的核心原理涉及两个二价阳离子及其配体之间的精确几何排列，以协同降低活化自由能障碍。

经典的几何排列

单价离子：新兴角色

在RNA生物学中，像K⁺（最丰富的细胞阳离子）和Na⁺离子这样的单价离子的作用几十年来主要被认为是对带负电的磷酸骨架的非特异性静电屏蔽，这对于RNA折叠成紧凑的三级结构至关重要[60]、[61]。虽然在一些核酶（如锤头核酶[62]和HDV核酶[63]以及II型内含子[16]）的结构口袋中发现了单价离子的特异性结合位点，但

对核酶中离子组合效应的计算洞察

多离子催化位点的动态和复杂性给单独的实验表征带来了重大挑战。静态的实验确定结构提供了宝贵的快照，但它们无法捕捉构象动态、瞬态中间体和定义反应路径的质子转移事件。虽然某些反应机制可以通过时间分辨X射线晶体学[65]或冷冻电镜在原子水平上确定，但这些

机制特定考虑

尽管催化位点的多离子框架是一个反复出现的主题，但超出Steitz和Steitz提出的通用双Mg²⁺离子方案[4]之外的精确化学机制似乎因系统而异[71]、[72]、[73]、[74]、[85]。然而，从计算研究中获得的知识使我们能够提出可能的通用原则。RNA代谢中机制路径的主要决定因素是

未来方向

深入理解RNA处理酶中扩展的双金属离子架构可能对生物技术和医学产生重要影响，特别是在基于RNA的治疗药物和基因编辑工具的合理设计方面。尽管冷冻电镜技术的最新进展提供了这些大型核糖核蛋白复合体的前所未有的视图，但这些结构往往代表复杂能量景观上的静态最小值，常常无法解析高度动态的变化

结论与展望

三十年前首次提出的双金属离子机制仍然是磷酸转移反应催化中的一个核心和统一原则。它在蛋白质和RNA酶中的保守性表明，这是一种稳健且高效的进化解决方案，解决了基本的生化挑战。然而，我们对这一机制的理解已从简单的静态图景发展为更加动态和细致的观点。

单价离子从背景中脱颖而出，成为

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

JB感谢斯洛文尼亚研究与创新机构（ARIS）的财政支持（项目编号：P1-0017）。AM感谢意大利癌症研究协会（AIRC IG项目编号24514）和欧盟下一代项目PRIN 2022（2022Z4FZE9和CUP: B53D23004670006）的财政支持。AM和JA感谢PNRR：基于RNA技术的国家基因治疗和药物中心CUP B83C22002860006 CN_0000004的支持。