高效氮去除过程无需经典基因的参与：解码Providencia manganoxydans AHY1菌独特的氮代谢网络

本研究发现普雷沃氏菌AHY1通过非典型代谢网络实现高效异养硝化-好氧反硝化，完整去除氨氮（2.65 mg/L/h）和亚硝酸盐（2.67 mg/L/h），并耐受5 mg/L镍和200 mg/L氨苄青霉素，其代谢机制整合了Dirammox-like途径、羟胺旁路及NorR-Hmp主导的反硝化系统。该研究揭示了微生物氮代谢的多样性机制，为复杂废水处理提供新策略。

　　

邹慧|王海燕|魏彦森|刘伟|叶青|曲超

北京工业大学环境科学与工程学院，中国北京100124

摘要

异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）是废水生物脱氮的关键策略，但其代谢复杂性仍不甚明了。本研究报道了一种新型菌株Providencia manganoxydans AHY1，尽管缺乏典型的核心基因（amo、hao、nirS/nirK、norBC、nosZ），但仍能高效进行HN-AD。AHY1菌株能够以2.65 mg/L/h的速率去除NH₄⁺-N，以2.67 mg/L/h的速率去除NO₃^--N，并且去除效率达到100%。综合多组学分析揭示了这一特殊能力的机制，发现了一个独特且非典型的代谢网络。该网络的核心包括一个基于基因组和转录组证据的Dirammox类似途径、一个活跃的羟胺旁路途径，以及一个以NorR-Hmp为主导的NO解毒途径，同时还涉及同化/异化硝酸盐还原和铵的吸收。此外，AHY1菌株对多种压力因素具有很强的耐受性，在5 mg/L的Ni²⁺条件下仍能保持96.24%的NH₄⁺-N去除效率，在200 mg/L的氨苄西林条件下仍能保持73.6%的去除效率。本研究提出了一个微生物氮循环的新机制模型，并强调了AHY1菌株在处理缺乏典型氮去除途径的复杂废水中的巨大潜力。

引言

全球氮污染危机日益严重，每年有超过60太克的氮通过农业活动释放到水生生态系统中，导致富营养化、NO₃^--N污染和生态失衡（Gu等人，2023年；S. Huang等人，2023年）。传统的生物脱氮方法依赖于顺序硝化-反硝化过程，但存在关键限制：（1）由于需要维持好氧和厌氧区域，运营成本较高，占污水处理厂总能耗的60%（Li等人，2021年）；（2）反应动力学缓慢，启动周期长，延缓了系统的稳定（Dan等人，2025年；Tec-Campos等人，2025年）；（3）容易受到环境干扰，如溶解氧波动、温度变化以及抗生素和重金属等抑制物质的影响（Roothans等人，2024年；Russell等人，2024年）。作为替代方案，异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）应运而生。通过复杂的代谢途径，该过程可以在一个好氧反应器中同时实现硝化和反硝化，从而简化工艺流程并降低运营成本（Q. Zhang等人，2024年；X. Zheng等人，2024年）。

已从多种环境中成功分离出多种HN-AD菌株，主要属于Acinetobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus和Klebsiella属（S. Li等人，2024年）。大多数HN-AD菌株的典型途径是完整的硝化-反硝化过程：NH₄⁺ → NH₂OH → (NO₂^– → NO₃^– → NO₂^– → NO → N₂O → N₂（Wehrfritz等人，1993年）。这一过程由一组相对保守的氧化还原酶催化：氨单加氧酶（AMO）和羟胺氧化酶（HAO）促进硝化，而亚硝酸盐还原酶（NirK/NirS）、一氧化氮还原酶（NorBC）和一氧化二氮还原酶（NosZ）促进反硝化（Richardson等人，1998年；Zhang等人，2012年）。

然而，高通量测序和多组学方法的最新进展挑战了人们对HN-AD代谢的传统认识，揭示了其更为复杂的机制。一些HN-AD菌株即使在没有典型核心基因（如amo和hao）的情况下也能高效去除氮，表明可能存在替代的酶促机制。例如，Alcaligenes ammonioxydans sp. nov.菌株HO-1缺乏amo和hao，但通过直接的氨氧化（Dirammox）途径，在异养条件下将NH₄⁺-N转化为NH₂OH，随后转化为N₂（Wu等人，2021年）。除了Dirammox途径外，氮的去除还可以通过其他途径实现，如异化硝酸盐还原为铵（DNRA）或同化硝酸盐还原（ANRA）（NO₃^- → NO₂^- → NH₄⁺），如Klebsiella sp TSH15（缺乏nirK/nirS）和Halomonas venusta SND-01（缺乏hao）所示（M.-Q. Huang等人，2023年；Ren等人，2024年）。这些途径依赖于关键酶，如异化/同化硝酸盐还原酶（如Nar/Nas）和亚硝酸盐还原酶（如NirB/NirA）。它们与典型途径共同构成了一个复杂的网络，涵盖了氨的吸收、同化硝酸盐还原和异化硝酸盐还原，体现了微生物氮代谢的灵活性（M.-Q. Huang等人，2023年；Qin等人，2024年）。尽管取得了这些进展，但完全缺乏典型核心基因（amo、hao、nirS/nirK、norBC、nosZ）且仍能高效去除氮的非典型HN-AD菌株仍然很少见。此外，在复杂的环境条件下，这些非典型网络的具体组成、调控机制和功能稳定性尚未完全明了。因此，阐明这些菌株在没有典型基因的情况下如何运作对于推进基础研究和开发新型脱氮技术至关重要。

本研究介绍了Providencia manganoxydans菌株AHY1的分离和特性分析，这是一种对β-内酰胺类抗生素和重金属具有双重抗性的新型HN-AD细菌。通过综合氮平衡分析、全基因组测序、无偏全局转录组学（RNA-seq）和RT-qPCR技术，发现了一个独立于典型硝化（amo、hao）和反硝化基因（nirS/nirK、norBC、nosZ）的独特氮转化网络。通过整合生理学、基因组和转录组学证据，本研究建立了Providencia的非典型HN-AD网络模型，从而深化了对微生物氮代谢机制的理解，并强调了该菌株在处理复杂工业废水中的适用性。

部分摘录

培养基制备

细菌菌株的富集使用LB培养基进行，而溴百里酚蓝（BTB）培养基用于筛选HN-AD细菌。在四种不同的氮条件下评估了氮代谢能力。（1）异养硝化培养基（HNM）含有50 mg/L的NH₄⁺-N（0.19 g/L NH₄Cl）、2.04 g/L的柠檬酸钠（C/N = 10）、1.50 g/L的KH₂PO₄、0.10 g/L的MgSO₄·7H₂O、7.90 g/L的Na₂HPO₄·12H₂O以及2 mL/L的微量元素溶液（He等人，2016年）。（2）反硝化培养基包括...

菌株AHY1的分类鉴定

AHY1菌株被鉴定为革兰氏阴性细菌，在LB琼脂上形成圆形、淡黄色的菌落，边缘光滑。扫描电子显微镜显示细胞呈直杆状（0.5-0.8 × 1.0-2.5 μm），表面有皱纹，并有聚集倾向，符合Providencia的典型形态（见补充材料）。其几乎完整的16S rRNA基因序列（1,536 bp；GenBank: PV570323）与Providencia manganoxydans菌株LLDRA6（MH644827.2）的序列有99.8%的同源性（Li等人，2022年）。系统发育分析...

结论

本研究确定Providencia manganoxydans AHY1是一种新型HN-AD菌株，尽管缺乏关键核心基因，但仍能高效去除氮。该菌株能够以2.65 mg/L/h的速率去除NH₄⁺-N，以2.67 mg/L/h的速率去除NO₃^--N，去除效率达到100%。多组学分析揭示了一个协调的非典型代谢网络，该网络由三个核心模块协同作用形成：一个类似Dirammox的途径（dnfBC）、一个羟胺旁路途径（pod/hcp）...

CRediT作者贡献声明

叶青：监督、项目管理。刘伟：验证、软件处理。魏彦森：方法学研究、数据整理。王海燕：写作、审稿与编辑、监督、资源提供、概念构思。曲超：资源提供、概念构思。邹慧：初稿撰写、可视化处理、数据分析、数据整理、概念构思

未引用参考文献

Huang等人，2023年；Li等人，2024年；Xie等人，2023年；Zhang等人，2024年；Zheng等人，2024年。

数据可用性

Providencia manganoxydans AHY1的完整基因组序列已存入NCBI GenBank数据库，登录号为CP194436（染色体）和CP194437（质粒）。所有相关数据均可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP194436.1公开获取

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：52330002）、总理特别研究基金（项目编号：DQGG0304）以及北京市教育委员会的研发计划（KM202410005018）的支持。