编辑推荐：
本研究探究全氟代烷酸PFDA与β-乳球蛋白（BLG）的相互作用机制。实验表明PFDA以剂量依赖方式改变BLG结构，通过竞争性结合维生素A（Kd≈3.2 μM），影响其运输功能，分子动力学模拟揭示PFDA与BLG形成盐桥及疏水作用。进一步在秀丽隐杆线虫中证实PFDA导致多巴胺能神经元缺失和运动能力受损，揭示了PFAS通过蛋白结构干扰和功能竞争产生多级毒理效应的机制。
作者名单：Daisy L. Wilson、Sayantani Chakraborty、Ummy Habiba Sweety、Hamidreza Sharifan、Jose A. Hernandez、Jason C. White、Lela Vukovic、Mahesh Narayan
所属机构：德克萨斯大学埃尔帕索分校环境科学与工程系，美国德克萨斯州埃尔帕索市，邮编79968
摘要
人类接触全氟癸酸（PFDA）这种氟表面活性剂后，可能会出现毒性健康问题，部分原因在于免疫反应受到抑制。然而，导致这些不良生理反应的分子机制至今仍不明确。本研究详细探讨了PFDA与牛奶蛋白β-乳球蛋白（BLG）之间的相互作用。研究结果表明，PFDA会以剂量依赖的方式干扰蛋白质结构。此外，PFDA与BLG的结合常数（Kd约为3.2 μM；ΔG = -7.5 kcal/mol）会降低该蛋白招募和结合视黄醇（维生素A）的能力，而视黄醇通常由脂质运载蛋白运输。这一现象通过测量PFDA存在下视黄醇与BLG结合的动力学得到验证。分子对接和分子动力学（MD）模拟揭示了PFDA的氟烷基尾部及极性头部与蛋白质侧链之间的多种分子相互作用，从而阐明了PFDA如何竞争视黄醇的结合位点并破坏蛋白质结构的机制。这些相互作用包括PFDA的-COO-基团与Lys60和Lys69之间的盐桥形成。为进一步研究PFDA在更复杂生物系统中的影响，研究人员将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）暴露于氟烷酸环境中，结果发现其多巴胺能神经元受损且运动能力下降。这些发现为PFDA如何影响蛋白质结构和功能、对人体产生毒性、作用于上游靶点以及制定风险缓解措施提供了重要线索。
引言
全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一类含有C-F键的烷基化合物，种类繁多。这类化学物质的“永久性”特性源于氟原子的强电负性，使得C-F键的解离能高达130 kcal/mol，使其比其他C-X、C-H和C-O键更稳定。
PFDA是一种广泛使用的PFAS化合物，应用于防污涂层、软垫和地毯以及食品包装。由于其独特的疏油和疏水性质，它在PFOA和PFOS之后成为研究最深入的PFAS之一，尤其因其对人类的毒性显著。PFDA的毒性源于其能够抑制炎症小体（inflammasome）的活性。暴露于PFDA的小鼠体内，IL-1β和IL-18的水平分别降低了7倍和16倍，caspase-1的活性受到抑制，多种NLRP炎症小体的mRNA水平也下降。此外，PFDA可使细胞色素家族（Cytochrome 2B10、3A11和4A14）的mRNA水平分别升高24倍、2.1倍和35倍，激活过氧化物酶体反应元件，并影响GSH和SOD蛋白的活性，导致脂质过氧化和红细胞氧化损伤。
在人类中，PFDA可能通过食物包装或接触含PFDA的产品间接进入体内，这些产品可能通过土壤、水和植物传播。对于新生儿和婴儿而言，母乳是PFAS的主要摄入途径，占其每日总摄入量的83-99%。事实上，无论地理位置如何，母乳中的全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）浓度往往超过儿童饮用水的安全标准。在一项针对50位哺乳期母亲的研究中，4-100%的样本中检测到了多种PFAS化合物，其中PFDA的检出率为94%，中位浓度为7.4 pg/ml。此外，婴儿配方奶粉中也可能含有PFAS。
鉴于牛奶和婴儿配方奶粉中存在疏水配体结合蛋白（如牛血清白蛋白和β-乳球蛋白），研究PFDA对牛奶蛋白结构和功能的影响变得尤为重要。最新研究表明，血清白蛋白、脂肪酸结合蛋白和有机酸结合蛋白能够运输PFAS。分子对接实验发现，全氟壬酸（PFNA）的羧基与血红蛋白、绿色荧光蛋白、牛血清白蛋白、β-Gal和IgG的氨基之间存在氢键相互作用。此外，氟化物还与多种蛋白质的侧链发生疏水接触。其他研究指出，PFAS会改变蛋白质的二级结构和螺旋结构。另有研究建立了PFAS与白蛋白之间的“功能”联系，白蛋白可作为PFAS的载体。
尽管已有数据初步揭示了PFAS与生物分子的相互作用机制，但在高分辨率建模和实验验证方面仍存在不足，这些机制涉及PFAS如何干扰蛋白质、DNA、RNA和碳水化合物的拓扑结构。这些干扰可能导致蛋白质部分或完全展开，影响其配体转运功能，进而引发一系列临床后果。为全面了解PFAS对生物分子的影响，我们通过实验和计算方法研究了PFDA对特定生物系统的作用，特别是PFDA与牛奶蛋白β-乳球蛋白的相互作用及其结构变化和功能影响。选择牛奶蛋白作为研究对象是因为牛奶（包括人乳、牛乳和婴儿配方奶粉）中确实含有PFAS污染物，这使得研究结果在生理学和环境学上具有重要意义。
实验材料
实验所需的化学物质包括PFDA（纯度≥99%）、β-乳球蛋白（BLG）、视黄醇、1-氨基-8-萘磺酸（ANS）和TRIS盐酸盐，均购自Sigma-Aldrich公司。
样品制备
PFDA（500 μM乙醇溶液）和BLG（18 mg/mL，溶于20 mM TRIS HCl（pH 7.3）溶液中）配制后储存在4°C环境中待进一步使用。视黄醇（1 mM）通过乙醇溶解制备。使用UV-Vis光谱仪（Chemglass Life Sciences SpecMate）对蛋白质和视黄醇溶液的浓度进行了验证。
PFDA对BLG的结构影响
图1A显示了PFDA剂量依赖性对BLG吸收光谱的影响。随着PFDA浓度从0增加到125 μM，BLG的吸收强度持续下降，尤其是在25至75 μM浓度范围内下降最为明显（见图1B）。这种吸收强度的变化表明PFDA与BLG发生了相互作用，导致蛋白质中Tyr和Trp残基所处的环境发生改变。
结论
本研究揭示了PFDA暴露对生物系统在分子、功能、细胞和整体水平上的影响。结果表明，PFDA会以剂量依赖的方式改变牛奶蛋白BLG的结构。蛋白质色素Tyr和Trp的吸收特性发生变化，可能是由于PFDA改变了这些色素所处的极性环境。
作者贡献声明
作者分工：
Sayantani Chakraborty：方法学设计、实验实施、数据分析
Ummy Habiba Sweety：方法学设计、实验实施、数据分析
Hamidreza Sharifan：文章撰写、审稿与编辑
Jose A. Hernandez：文章撰写、审稿与编辑
Jason C. White：文章撰写、审稿与编辑
Lela Vukovic：文章撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据分析
Mahesh Narayan：文章撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目指导、概念框架制定
Daisy L.：整体协调
作者声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
作者感谢美国国立卫生研究院（NIH/NIGMS）下属的国家普通医学科学研究所（NIGMS）在项目1R16GM145575-01项目中的支持。DLW和MN感谢Ciudad Juárez技术学院（ITCJ）的Marco Gallo博士在论文修订过程中提供的宝贵意见。同时，我们也感谢边境生物医学研究中心的细胞表征与生物库核心设施的所有工作人员的支持。
