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本研究针对亚麻籽油精炼过程中超过98%的环肽（CLs）被废弃的问题，研究人员开展了甲醇-K2HPO4水相两相萃取（ATPE）体系的优化研究，以高效回收亚麻籽粕中的环肽。结果发现，优化后的ATPE体系（14% K2HPO4, 44% 甲醇，料液比1:30，pH 8.7）回收率约为79%，所获环肽混合物（CLMIX）及主要单体CLA在人真皮成纤维细胞（HSFs）的H2O2诱导衰老模型中，展现出显著的抗氧化、抗衰老（抑制SA-β-gal活性、下调ROS、调节BCL2/BAX通路）及抑制胶原降解（下调MMP-1/3）的细胞保护作用。该研究成功将亚麻籽加工废弃物转化为具有高附加值的功能性食品级成分，为农业副产物高值化利用提供了可行的技术方案。
想象一下，被誉为“植物鱼油”的亚麻籽油，因其富含的ω-3 α-亚麻酸而备受健康食品界推崇。然而，一个矛盾随之而来：这些宝贵的多不饱和脂肪酸极易氧化，导致油脂保质期大大缩短。为了解决这个难题，传统精炼工艺应运而生，但令人惋惜的是，在追求油脂稳定性的同时，一种同样蕴含巨大潜力的天然宝藏——亚麻籽环肽（Cyclolinopeptides, CLs），却作为废弃物被无情丢弃，损失率超过98%。CLs是亚麻籽中一类独特的环状多肽，初步研究显示它们具有清除自由基、抑制脂质过氧化等抗氧化活性。随着功能性食品对天然抗衰老成分的需求日益增长，这些被遗弃的环肽无疑是一座待开发的“金矿”。那么，如何从亚麻籽加工的副产物——亚麻籽粕中，高效、环保地回收这些环肽？回收后的环肽是否真的具有我们所期待的生物活性，例如保护皮肤细胞、抵抗氧化应激引发的衰老？这正是Jiayang Xu、Jiefang Huang、Ming Chang等研究人员决心要探索的课题。
他们的研究成果最终发表在国际期刊《Food Chemistry: Molecular Sciences》上。为了回答上述问题，研究团队系统性地开展了两方面工作：首先是优化提取工艺，然后是深入验证生物活性。在技术上，他们主要运用了几个关键方法：采用甲醇-K2HPO4水相两相萃取（Aqueous Two-Phase Extraction, ATPE）体系，并对盐浓度、甲醇含量、料液比、pH等条件进行单因素优化，以高效纯化亚麻籽粕中的环肽混合物（CLMIX）。利用高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）对提取物中的环肽（特别是主要单体[1–9-NαC]-linusorb B3，简称CLA）进行定性和定量分析。建立了H2O2诱导的人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts, HSFs）衰老模型，以此评估环肽的细胞保护作用。运用了包括MTT法检测细胞活力、β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老细胞、流式细胞术检测活性氧（ROS）水平和细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI双染）、以及实时定量PCR（qPCR）检测相关基因（如P21、IL1A、IL1B、MMP-1、MMP-3、BCL2、BAX等）mRNA表达水平在内的多种细胞和分子生物学技术。
优化环肽提取的甲醇-K2HPO4水相两相系统
研究人员系统优化了ATPE的各个参数。结果发现，盐浓度、甲醇含量、料液比和pH均显著影响环肽的分配系数（K）和提取率（Y）。最终确定的最佳条件为：K2HPO4浓度14%、甲醇含量44%、料液比1:30（w/w）、pH 8.7。在此条件下，环肽的提取率可达约79%，分配系数为0.77。这一优化的ATPE过程成功地从复杂的亚麻籽粕提取物中富集了环肽，为后续的生物活性研究提供了物质基础。
建立衰老细胞模型和细胞毒性测定
为了评估回收环肽的价值，研究首先需要建立一个可靠的研究模型。他们使用不同浓度的H2O2处理HSFs，发现150 μM H2O2处理可使细胞活力保持在80%左右，并能显著增加SA-β-gal阳性细胞的比例，成功诱导了细胞衰老样表型，因此选择此浓度用于建立后续的氧化应激诱导衰老模型。
CLMIX对H2O2诱导衰老HSFs的生物活性评估
研究人员将纯度约为73%的CLMIX用于HSFs实验。MTT实验表明，在H2O2存在下，120 μg/mL的CLMIX能最佳地恢复细胞活力。qPCR结果显示，该浓度的CLMIX能显著降低细胞衰老标志物（细胞周期阻滞相关蛋白P21和衰老相关分泌表因子IL1A、IL1B）的mRNA水平，初步证明了CLMIX的抗衰老潜力。
CLMIX通过调节氧化应激-凋亡轴发挥细胞保护作用
进一步的机制探索表明，CLMIX能有效降低H2O2诱导的细胞内ROS异常升高。通过Annexin V-FITC/PI双染色流式检测发现，CLMIX能显著减少H2O2引起的细胞凋亡。此外，CLMIX还能下调基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和MMP-3的mRNA表达，这两个酶是降解胶原蛋白的关键，提示CLMIX可能通过抑制胶原降解途径来保护皮肤基质。
一种环肽单体——CLA重现了CLMIX的细胞保护活性
CLA是CLMIX中最丰富的单体成分。研究发现，20 μg/mL的CLA在H2O2诱导的衰老HSFs中，能像CLMIX一样最佳恢复细胞活力，显著减少SA-β-gal阳性细胞数量，并下调P21、IL1A、IL1B等衰老标志物的表达。这表明CLA单体足以承载CLMIX的核心生物活性。
环肽价值提升的分子基础：BCL2/BAX介导的抗凋亡信号
为深入阐明机制，研究聚焦于结构明确的CLA。结果表明，CLA同样能降低细胞内ROS水平并抑制细胞凋亡。关键发现在于，CLA能上调抗凋亡蛋白BCL2的mRNA表达，同时下调促凋亡蛋白BAX的mRNA表达。BCL2/BAX的平衡是调控细胞凋亡的关键节点，这一结果提示，CLA可能通过调节BCL2/BAX信号轴，来对抗氧化应激驱动的细胞凋亡，从而发挥其抗衰老和保护细胞的作-用。
综上所述，本研究成功开发了一种优化的甲醇-K2HPO4ATPE策略，能够以约79%的回收率从亚麻籽粕中提取环肽，实现了加工副产物的高值化转化。提取出的环肽，尤其是CLA，在细胞模型中展现出强大的抗氧化、抗衰老（抑制SA-β-gal活性、调节衰老相关基因）、抗凋亡（调控BCL2/BAX轴）以及抑制胶原降解（下调MMP-1/3）的多重细胞保护效应。这些发现不仅揭示了亚麻籽环肽，特别是CLA，作为功能性食品成分在抵抗皮肤氧化衰老方面的应用潜力，更重要的是，为大规模回收利用亚麻籽油精炼过程中的废弃资源提供了切实可行的工艺方案和扎实的科学依据。它将一个农业和食品加工中的废弃物难题，转化为开发高附加值健康产品的机遇，延伸了食品源生物活性肽在营养健康干预中的应用场景，体现了循环经济和可持续开发的理念。当然，研究也指出了未来需要探索的方向，如体内功效验证、CLA与其它环肽单体的协同作用、以及工业化放大生产的可行性比较等。这项研究为深入挖掘植物源环肽的多样化生物活性，并最终将其应用于功能性食品、天然防腐剂和营养健康干预产品，奠定了重要的基础。
