《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Microfluidization-assisted alkaline extraction enhances structural, functional, and nutritional properties of bael seed protein isolate
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巴豆种子蛋白通过微流化-碱提法显著提升回收率与功能特性，160MPa处理使蛋白产量达35.9%、溶解性62%，消化性提高25.64%，抗氧化活性增强31.23%。
关键作者：Keyur Saliya、Geetarani Liklam Loushigam、Rushali Jaiswal、Prarabdh C. Badgujar、Kiran Verma、Lalit Pratap Singh、Mahesh Shivanand Dige
印度哈里亚纳邦Sonipat市Kundli的国家食品技术创业与管理研究所食品科学与技术系，邮编131 028
摘要
本研究提出了一种利用微流控辅助碱性提取（MF-AE）的新方法，以提高贝勒果（bael fruit）种子蛋白分离物（BSPI）的回收率和功能性。贝勒果种子蛋白分别采用传统的碱性提取方法（对照组）和微流控辅助碱性提取方法（MF-AE，在80、120、160、200 MPa压力下进行）进行提取，随后通过等电沉淀法评估其蛋白质产量、结构与功能特性、消化率和生物活性。结果显示，在160 MPa压力下，蛋白质产量显著增加（35.9%），同时蛋白质溶解度也有所提高（62.00%，而对照组分别为22.15%和38.99%）。在该压力下，乳化能力和持水能力分别比对照组提高了125%和45%。结构分析（SEM、FTIR和SDS-PAGE）表明，中等压力（80–160 MPa）下的微流控处理破坏了蛋白质聚集体并减小了颗粒大小；而过高压力（200 MPa）则导致蛋白质重新聚集。MF-AE还显著提高了体外蛋白质消化率（85.83%，对照组为67.14%），并改善了氨基酸组成，尤其是增加了疏水性和必需氨基酸的含量。这些结构和组成变化使得抗氧化活性显著增强，DPPH和FRAP检测结果显示抗氧化活性分别提高了25.64%和31.23%。我们的研究首次证明MF-AE能够显著提高BSPI的回收率和功能性，展示了其作为改善贝勒果种子衍生蛋白/成分性能的加工策略的潜力。
引言
由于人口增长、城市化和健康意识的提高，全球对蛋白质的需求正在迅速增加（Loushigam, Badgujar等人，2025年）。虽然传统的动物源性蛋白质来源如肉类、乳制品和鸡蛋长期以来一直主导着蛋白质供应，但它们的生产存在环境和伦理问题，包括高温室气体排放、森林砍伐、高水资源消耗和生物多样性丧失（Sridhar等人，2024年）。与大量摄入红肉和加工肉类相关的健康风险（如心脏病和某些癌症）促使人们转向植物性蛋白质（Hanley等人，2025年；Satija & Hu，2018年）。因此，植物性蛋白质作为一种可持续且符合健康需求的替代品越来越受欢迎（Loushigam, Badgujar等人，2025年）。预计到2050年，全球蛋白质需求将增加30–50%，这一趋势不仅受到素食者和纯素食者的推动，也受到希望减少动物源性食物摄入的弹性饮食者的推动（Chen等人，2024年）。富含蛋白质的油籽、水果和农业废弃物副产品引起了研究人员的极大兴趣。尽管这些副产品具有潜力，但它们大多被用作牲畜饲料或直接丢弃。然而，它们可以成为廉价且可持续的蛋白质来源（Loushigam & Shanmugam，2023年）。已知多种废弃物来源是良好的蛋白质来源，包括大豆、葵花籽、南瓜籽、瓜穆奇尔籽、芥花籽、大麻籽、卡苏里葫芦巴籽等（Chandran等人，2023年）。这些蛋白质因其功能性特性而在食品制造中得到应用，如肉类替代品、乳制品替代品、蛋白质棒和零食等。在农业工业副产品中，尽管水果籽和果核在食品应用方面具有潜力，但尚未得到充分探索。多项研究报道了从南瓜籽、芒果籽、鳄梨籽、荔枝籽、木瓜籽、柠檬籽和黑莓籽中提取蛋白质的情况，表明它们具有作为植物性蛋白质资源的潜力（Lolli等人，2023年；Wang等人，2023年）。
其中一种未得到充分利用的植物蛋白来源是贝勒果（Aegle marmelos）籽。贝勒果以其药用价值而闻名，在阿育吠陀医学中有着悠久的应用历史。在东南亚许多地区，尤其是印度，人们常将其制成果汁或果酱食用（Sharma等人，2024年）。然而，关于贝勒果的研究非常有限，主要集中在其传统用途上。最近的研究探讨了巴氏杀菌方法以提高贝勒果果肉饮料的稳定性（Dhar & Chakraborty，2024年）、利用贝勒果废弃物生产生物膜（Sonu等人，2025年），以及利用超声波辅助从果壳废弃物中提取纳米多糖（Sharma等人，2024年）。然而，贝勒果的种子作为果汁/食品加工的副产品，以及阿育吠陀医学的副产品，大多被丢弃或用作低价值的动物饲料或肥料（Ge等人，2021年）。
贝勒果籽因其富含蛋白质和油脂而具有很高的价值潜力，同时适合用于食品和营养保健品配方中。根据Rao等人（2011年）的研究，贝勒果籽粉含有34.7%的粗蛋白，使其成为一种营养价值高的植物性蛋白质来源。其他水果籽和果核也被认为是适合提取和功能性利用的高蛋白基质，例如苹果籽（约33–34%蛋白质）、杏核（约23–25%）、甜樱桃籽（约37–38%）、葡萄柚籽（约26%）、印度枣籽（约36%）和西瓜籽（约30%）（Katariya等人，2025年；Roy等人，2024年）。这些发现强调了水果籽副产品作为替代蛋白质来源的日益重要性，并进一步突显了贝勒果籽作为传统植物蛋白来源的可行性和可持续性。此外，研究还表明贝勒果籽蛋白中含有必需氨基酸，其营养价值与其他广泛消费的植物蛋白相当（Bajaniya等人，2015年；Bhattacherjee等人，2019年）。尽管具有这些潜力，但关于贝勒果籽蛋白的提取、分离和特性分析的研究仍然有限。充分利用这一未被充分利用的副产品可以为食品生产提供经济高效且环保的解决方案，有助于实现可持续发展和减少浪费。
传统的蛋白质提取方法（如溶剂提取、碱性溶解、盐提取和酸沉淀）由于使用化学物质和高温，往往导致纯度和功能性的降低（Anyiam等人，2025年；Medha等人，2025年）。为了解决这些问题，绿色提取和/或蛋白质修饰技术（如超声波辅助提取、酶水解和微流控）因其在提高产量、纯度和功能性方面的有效性而受到关注（Ranasinghe等人，2024年；Tang等人，2024年；Zou等人，2025年）。尽管这些技术之间的直接比较研究有限，但对菠萝蜜叶蛋白提取的比较研究表明，新兴的物理方法显著提高了蛋白质回收率：超声波处理为96.3 mg/g，微波处理为95.6 mg/g，高压处理为147.3 mg/g，而溶剂提取仅为84.1 mg/g（Moreno-Nájera等人，2020年）。这些观察结果表明，高能量、非热处理方法在破坏植物基质和促进蛋白质释放方面非常有效。微流控技术同样利用高压流体流、冲击射流技术、强烈剪切和流体动力空化作用，成为一种有前景且可扩展的替代方案，无需化学添加剂即可高效破坏植物细胞和蛋白质聚集体。尽管目前缺乏跨方法评估的明确数据（Ghanghas等人，2025年；Sethi等人，2022年），但微流控技术已成功应用于多种植物基蛋白质废弃物中，包括瓜尔胶粉（Jojo等人，2025年）、紫苏籽（Kamboj等人，2024年）、莲花籽（Zheng等人，2022年）和杏仁粉蛋白（Sari等人，2024年）。然而，在上述所有研究中，微流控技术主要用于提取后的修饰步骤，而不是提取过程的核心部分。
微流控的运作原理与传统的高能均质化技术（如转子-定子均质化和超声波处理）有根本不同。在微流控过程中，液体物料被强制通过一个微相互作用室，在其中分成多股微流，以高速度碰撞，产生极高的剪切率、压力差、湍流、振动和流体动力空化（Ghanghas等人，2025年）。由于其强烈的机械作用，微流控有望更有效地破坏细胞壁，增强蛋白质溶解，并在提取过程中控制结构变化，从而提高蛋白质的回收率和功能性。随着处理压力的增加，细胞破裂程度逐渐加剧，进一步降低了溶质扩散的阻力，提高了目标化合物的溶解度（Huang等人，2023年）。关于使用动态高压处理来提高蛋白质提取率及其物理功能特性的研究，我们在文献中尚未找到相关资料。不过，最近有研究将微流控辅助提取应用于肾豆蛋白的提取，但采用了略有不同的方法：在碱性pH调整和离心之后进行微流控处理（Singhi & Ozturk，2026年），而不是直接在碱性溶解步骤之后进行。相比之下，本研究在碱性溶解之后和离心之前使用微流控处理，以便直接评估其在增强蛋白质提取能力方面的效果。
材料
贝勒果籽从印度Lucknow的Kisan Seeds公司购买。ANS（8-氨基-1-萘磺酸）、胰酶（8×USP规格）、胃蛋白酶（≥250单位/毫克）和2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）从印度Bengaluru的Sigma-Aldrich公司购买。所有其他试剂均为分析级，购自Sigma-Aldrich或HiMedia（印度Mumbai）。
原材料制备
贝勒果籽在50°C的托盘干燥机中干燥6小时，去壳并清洗干净。
蛋白质纯度和蛋白质提取率（PEY）
首先对所有BSPI样品的蛋白质纯度进行了评估，以确认回收组分的性质。凯氏定氮法显示所有样品的蛋白质含量均较高，从对照组的86.27%到MF-AE组的92.72%不等，其中160 MPa压力下的纯度最高（表1）。这些数据表明回收的组分属于蛋白质分离物而非蛋白质浓缩物，说明非蛋白质成分的共提取量很小（见表2）。
接下来...
结论
本研究证明，微流控辅助碱性提取是一种有效的方法，可以提高从贝勒果籽中提取的蛋白质分离物的提取率和质量特性。通过将微流控技术整合到提取过程中，可以在不使用化学修饰剂的情况下控制蛋白质结构的改变，从而提高其功能性和营养价值。
作者贡献声明
Keyur Saliya：撰写初稿、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。
Geetarani Liklam Loushigam：撰写初稿、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。
Rushali Jaiswal：方法设计、实验设计、数据分析。
Prarabdh C. Badgujar：撰写、编辑与可视化、验证、软件使用、资源管理、项目协调、方法设计、实验设计、资金筹集。
未引用参考文献
Loushigam, Prithya, Sari and Badgujar, 2025
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢国家食品技术创业与管理研究所（NIFTEM-K）提供的必要资金和支持，以完成这项工作。NIFTEM-K的内部手稿编号为NIFTEM-P-2026-16。
