HaGATAe通过蜕皮激素响应性转录因子调节Helicoverpa armigera中的几丁质合成酶2（chitin synthase 2）和昆虫肠道黏蛋白（insect intestinal mucin）的表达

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：HaGATAe regulates chitin synthase 2 and insect intestinal mucin expression with ecdysone responsive transcription factors in Helicoverpa armigera

本研究发现家蚕蛹纹蛱蝶转录因子HaGATAe通过结合GATA位点直接调控中肠周细胞膜（PM）的关键结构蛋白CHS2和IIM80的表达，维持PM完整性，同时蜕皮酮信号通过EcRb增强和HR3抑制双重机制影响其表达动态，为靶向PM的害虫管理提供理论依据。

　　

作者：朗金（Lang Jin）、荣萍英（Pinying Rong）、徐敏（Min Xu）、边慧兰（Huiran Bian）、张俊（Jun Zhang）、杨永波（Yongbo Yang）、刘凯宇（Kaiyu Liu）

中国华中师范大学生命科学学院，教育部农药与化学生物学重点实验室，武汉 430070

摘要

围食膜（peritrophic matrix，PM）是昆虫体内重要的肠道屏障，其关键结构成分包括几丁质合成酶2（Chitin Synthase 2，CHS2）和昆虫肠道黏蛋白（Insect Intestinal Mucin，IIM）。然而，调控这些基因表达的机制至今仍不明确。本研究鉴定出HaIIM80为棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫中表达量最高的几丁质结合蛋白基因。通过双荧光素酶检测、DNA免疫沉淀、RNA干扰、组织学分析及功能实验，我们发现转录因子HaGATAe可通过多个GATA结合位点与HaCHS2和HaIIM80的启动子结合，从而上调它们的表达并维持PM的完整性。敲低HaGATAe会导致肠道几丁质含量和PM厚度下降，增加对HaNPV的敏感性，但降低对Vip3Aa毒素的敏感性。此外，蜕皮激素反应因子HaEcRb可增强HaGATAe对HaCHS2和HaIIM80的激活作用，而HaHR3则抑制这种激活，这与它们在蛹期中的表达模式一致。RNAi干扰HaHR3、饥饿处理以及使用蜕皮激素激动剂甲氧苯氧唑（methoxyfenozide）的处理结果也进一步支持了这一调控机制，表明蜕皮激素信号通路调控着HaCHS2和HaIIM80的表达。此外，HaE75C（一种HaHR3抑制剂）及其配体血红素（heme）也能上调这两种蛋白的表达。这些发现揭示了影响PM形成的转录调控网络，并为破坏肠道屏障功能的害虫管理策略提供了潜在靶点。

引言

围食膜（PM）是由大多数昆虫的中肠细胞分泌的无色透明管状结构，主要由几丁质和糖蛋白组成（Wang和Granados，2000；Shi等，2004；Kelkenberg等，2015）。作为昆虫消化系统的关键屏障和功能组件，PM吸引了大量研究关注。几丁质合成酶2（CHS2）是已知唯一在PM内合成几丁质的酶（Toprak等，2014；Kelkenberg等，2015）。CHS2功能受损会破坏PM的完整性（Zhang等，2020）。此外，CHS2可能作为Bt毒素的受体，其下调可提高Spodoptera frugiperda对表达Vip3Aa的转基因作物的抗性（Liu等，2024）。 昆虫肠道黏蛋白（IIMs）是一类富含几丁质的结合蛋白，具有很强的几丁质亲和力和广泛的糖基化修饰。这些修饰使IIMs的分子量远高于理论值，从而保护几丁质和IIMs免受酶降解。IIMs通过与几丁质的紧密结合形成保护性糖层，有助于维持PM的完整性并阻止病原体入侵（Lepore等，1996；Wang和Granados，1997a，1997b）。研究表明，IIMs可影响常用杀虫剂（包括Bt毒素和杆状病毒）对鳞翅目害虫的杀虫效果（Fang等，2009；Ito等，2018；Guo等，2019；Güney等，2024）。然而，目前尚未发现直接调控CHS2和IIMs表达的转录因子。 在昆虫生命周期中，PM会经历动态变化。例如，当昆虫在蛹期停止进食时，PM结构会消失（Lehane，1997）。相应地，中肠中CHS2和IIMs的表达水平显著下降。在Cryptolestes ferrugineus中，CHS2的表达在蛹期达到最低（Zhang等，2020）；在Ostrinia furnacalis中，CHS2的表达从蛹期到成虫期持续较低（Qu等，2011）。在棉铃虫（Helicoverpa armigera）和Plutella xylostella中，IIMs在幼虫期表达量较高，但在蛹期到成虫期表达量显著降低（Israni和Rajam，2017），这表明激素调节可能通过控制CHS2和IIMs的表达来影响PM的动态变化。在Spodoptera exigua中，注射20-羟基蜕皮激素（20E）可迅速上调CHS2的表达。这种20E诱导的上调作用可被蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（cycloheximide）完全抑制，表明20E通过新生蛋白质合成而非直接改变蛋白质功能来上调CHS2表达（Yao等，2010）。此外，敲低蜕皮激素受体基因（EcR）（Yao等，2010）、E74（Zhang等，2022）和Broad Complex（BR-C）（Ding等，2020）可抑制多种昆虫的幼虫CHS2表达，尽管其具体机制尚不清楚。 IIMs在不同物种间的序列保守性较低，这限制了对其转录调控的研究。在昆虫中，IIMs通常在中肠中高表达。对棉铃虫（H. armigera）PM的蛋白质组学分析发现HaIIM1是主要的IIM成分（Campbell等，2008）。该蛋白含有四个几丁质结合域（CBDs），与已知作为enhancin底物的HaIIM86具有高度序列相似性（Zhang和Guo，2011）。在本研究中，我们鉴定了H. armigera中的一个新IIM基因HaIIM80，其可能与HaIIM1和HaIIM86来源于同一基因。我们以HaIIM80为模型探讨了IIMs的表达调控机制。 在先前的研究中，对HaGATAe转基因细胞的转录组分析表明HaGATAe可能调控CHS2和几丁质结合蛋白（CBPs）的表达（Wang等，2024）。在哺乳动物中，GATA-4可诱导肠上皮组织中杯状细胞的分化，从而促进黏蛋白的合成和分泌（van der Sluis等，2004；2008）。通过生物信息学分析和实验验证，我们确认HaGATAe（GATA-4的同源物）直接调控HaCHS2和主要的中肠几丁质结合蛋白HaIIM80的表达，从而维持PM的完整性。此外，蜕皮激素反应因子HaEcRb和HaHR3影响HaGATAe对HaCHS2和HaIIM80的激活，并影响它们在蛹期的表达动态。本研究旨在阐明调控关键PM相关蛋白CHS2和IIM的转录网络，为开发针对PM的害虫控制策略提供理论基础。

材料

昆虫和细胞系：来自中国济源市白云工业公司的棉铃虫（H. armigera）卵和幼虫，在29°C和80%相对湿度下，14小时光照：10小时黑暗的光周期条件下进行培养。Sf9细胞系（源自Spodoptera frugiperda卵巢；Vaughn等，1977）在添加10%胎牛血清的Grace昆虫细胞培养基中于28°C条件下培养。过表达空载体pIE2-His和pIE2-HaGATAe（C末端）

HaIIM80在PM中可能高表达

对棉铃虫（H. armigera）三龄期中肠的转录组分析鉴定出51个含有几丁质结合域的蛋白基因，其中HaIIM80（LOC110374888）的表达量最高（图1A）。在Sf9细胞中瞬时表达HaIIM80-Flag及其突变体17-HaIIM80（缺乏N端16个氨基酸的信号肽）后，观察到它们在细胞内的不同定位（图1B）。Sf9细胞中瞬时表达HaIIM80-Flag产生的目标蛋白分子量超过180 kDa，可通过Western blot检测到（图1）。

讨论

GATAe是昆虫中肠分化的关键调控因子，对大多数中肠标记基因的表达至关重要（Okumura等，2007；Okumura等，2016）。在棉铃虫（H. armigera）中，HaGATAe可激活多种中肠特异性基因，包括一系列Bt受体基因（Guo等，2015；Wei等，2020；Wang等，2024）。本研究证明HaGATAe通过结合多个GATA结合位点直接调控HaCHS2和HaIIM80的表达。HaGATAe的RNAi抑制了...

CRediT作者贡献声明

张俊（Jun Zhang）：研究工作。 杨永波（Yongbo Yang）：撰写、审稿和编辑。 徐敏（Min Xu）：研究、数据管理。 边慧兰（Huiran Bian）：方法学设计、研究。 朗金（Lang Jin）：撰写初稿、可视化处理、验证、软件应用、方法学设计、研究、数据分析、概念构建。 荣萍英（Pinying Rong）：方法学设计、研究、数据分析。 刘凯宇（Kaiyu Liu）：撰写、审稿和编辑、项目监督、资源协调、资金申请、数据分析、概念构建。

未引用参考文献

Ramneek和Ren，2002；Zhang等，2021。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2017YFD0200400）的支持。