《Inorganic Chemistry Communications》：Hemicyanine-based chemosensor for the detection of CNˉ and HSˉ ions: application in food, water samples, and in-vitro cell imaging studies
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双响应荧光探针PIM1的合成及其对CN?和HS?的检测研究。该探针基于血红素氰化物结构，通过C=N+和C=C双键的特异性反应实现CN?和HS?的同步检测，具有0.37 μM和0.39 μM的超低检测限，适用于食品、水和活细胞成像分析。
作者名单：
Yesudhasan Chinnaraj | Muniyappan Chinnamadhaiyan | Abdul Majeed Kurumbala | Murugesan Rajesh | Sepperumal Murugesan | Jeyakumar Prabakaran | Nagamalai Sakthi Vignesh | Balasubramaniem Ashokkumar | Perumal Varalakshmi | Manickam Selvaraj | Siva Ayyanar
印度泰米尔纳德邦马杜赖卡马拉杰大学化学学院超分子与有机金属化学实验室，邮编625 021
摘要
本文介绍了一种新型基于花青素的荧光化学传感器PIM1的设计与详细表征。该传感器在检测CN?和HS?离子方面具有更高的灵敏度、选择性和实用性。PIM1具有优异的溶解性、显著的斯托克斯位移（Stokes shift），在纯DMSO-H?O（1:1，体积比）介质中能够迅速从粉红色变为无色，并且荧光强度显著增强。其检测原理基于两种不同的反应机制：CN?通过亲核加成作用于亚胺键（C=N+），而HS?则引发C=C键断裂，这两种反应均通过分子内电荷转移（ICT）过程产生光学变化。PIM1表现出极强的选择性，对常见阴离子无干扰，CN?的检测限为0.37 μM，HS?的检测限为0.39 μM，远低于世界卫生组织（WHO）规定的饮用水安全标准。光谱研究结果通过密度泛函理论（DFT）和时间依赖密度泛函理论（TD-DFT）计算得到验证，进一步证实了其电子跃迁机制。此外，PIM1在真实食品和水样中的定量分析表现出良好的生物相容性和渗透性。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的活细胞荧光成像实验也证实了其适用于生物和环境检测。
引言
环境和生物系统中活性化学物质及有害阴离子的日益增多，促使人们开发出有效的检测方法。阴离子在工业、医药和生理学领域中具有重要作用，但它们的失调或积累可能带来严重的毒性后果[1]。因此，准确检测氰化物（CN?）和硫化氢（H?S/HS?）等危险离子已成为超分子化学和环境毒理学研究的核心目标。氰化物因其高毒性而在环境中普遍存在，常作为金矿开采、电镀、纺织品生产、药品制造和塑料生产等工业过程的副产品释放[2][3][4][5][6][7][8]。某些可食用作物（如木薯、杏仁、高粱和土豆）中也含有氰苷，如果处理不当，可能导致人体摄入并引发神经系统损伤或死亡[9][10][11][12][13][14]。氰化物的毒性主要通过抑制线粒体电子传递链中的细胞色素c氧化酶发挥作用，从而干扰氧化磷酸化过程，导致细胞能量不足、ATP耗竭和细胞死亡[15][16][17][18][19][20]。鉴于这些危害，监管机构制定了严格的安全标准，例如美国环保署（EPA）和世界卫生组织（WHO）将饮用水中的氰化物允许浓度分别设定为2.0 ppm和1.9 μM[21][22][23][24][25]。
硫化氢（H?S）作为一种重要的气体信号分子，与一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）一同被归类为第三类内源性气体递质，由半胱硫氨酸β-合成酶（CBS）、半胱硫氨酸γ-裂解酶（CSE）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（MST）在哺乳动物体内生成[10][26][27][28][29]。在30–160 μM的浓度范围内，H?S对神经传导、血管舒张和胰岛素信号传导等生理功能至关重要，但过量暴露会导致急性细胞毒性[30][31][32][33][34][35]。因此，同时监测CN?和H?S对于环境监测及其生物学功能研究至关重要。尽管检测需求迫切，但传统分析方法（如气相色谱、伏安法和电化学分析）在空间分辨率、样品制备复杂性以及活细胞内原位成像能力方面存在局限[36][37][38][39][40]。荧光化学传感器凭借高灵敏度、易用性和实时监测的非侵入性优势克服了这些限制[41][42][43][44][45]。近期传感器设计的发展主要集中在基于半花青素的框架上，这类探针具有可调的光物理特性和近红外（NIR）激发兼容性，能有效减少生物自荧光并提高组织穿透性。双响应传感器结合了CN?的亲核加成能力和HS?的多种反应活性（如迈克尔加成、叠氮化物还原或巯基化反应[46][47][48][49][50][51]），但开发能够同时检测这两种物质的单分子传感器仍面临挑战。现有双分析物传感器通常受斯托克斯位移有限、水溶性不足和交叉干扰等问题限制[52][53][54][55][56][57][58][59][60]。
本文设计并合成了一种新型基于半花青素的荧光探针PIM1，通过引入9-苯基菲基团来改善其性能。这种结构改动增强了π共轭，使得发射光谱向红光方向移动，更适合近红外成像。PIM1通过C=C和C=N+位点的独立亲核加成反应实现双重检测，分别对CN?和HS?产生选择性的比色和荧光响应。我们通过检测食品样品（如苹果籽和木薯）和环境水中的氰化物，以及实时监测活细胞中的硫化氢，验证了PIM1在食品安全和生物医学诊断领域的应用潜力。
1,1,2-三甲基苯[ε]吲哚、碘甲烷、哌啶、9-溴苯并蒽和4-甲酰苯硼酸购自TCI、Sigma和Merck Ltd（印度）。其他试剂均从商业供应商处购买，无需进一步纯化。实验过程中使用去离子水以避免离子干扰。1H和13C核磁共振（NMR）数据在BRUKER AVANCE 400 MHz光谱仪上记录，化学位移（δ）以ppm为单位表示，内标物为TMS，溶剂为DMSO-d6。
1,1,2-三甲基-1H-苯[ε]吲哚骨架因其能产生长波长发射而广泛应用于荧光探针设计，尤其是用于检测有害物质。当与苯花青素染料结合时，该体系可形成活性的C=C和C+N+键，这种电子缺陷结构增强了π共轭效应。为提高选择性和减少常见离子的干扰，N-烷基化的苯[ε]吲哚核心被进一步修饰...
为阐明PIM1对CN?和HS?的选择性检测机制，采用Gaussian 09软件和B3LYP/6-31G基组进行了密度泛函理论（DFT）计算。优化后的PIM1及其与CN?和HS?复合物的结构和轨道能量见图S13。未结合态的PIM1最高占据分子轨道（HOMO）在整个分子中分布；而最低未占据分子轨道（LUMO）则主要位于...
通过时间相关单光子计数（TCSPC）技术测量了PIM1在CN?和HS?存在下的荧光衰减特性，获得高分辨率的发射衰减曲线。纯PIM1、PIM1-CN和PIM1-HS的平均荧光寿命均为0.19 ns（图12a–b，表S1），表明探针与阴离子结合后其荧光特性基本保持不变。
实验发现PIM1对CN?和HS?的响应具有明显的时间依赖性。在DMSO/H?O（1:1）溶液中，595 nm处的荧光强度在加入CN?或HS?后迅速下降，表明探针中的ICT过程反应迅速且高效。
通过发射光谱研究了PIM1在不同pH条件下的响应情况。PIM1在PBS缓冲液（pH 2–10）中的行为稳定，表明pH变化不影响其亲核加成机制...
我们开发了一种原型试纸，用于可视化及荧光法检测DMSO/H?O（1:1）中的CN?和HS?。Whatman纸、硅胶和棉基底浸入10 μM PIM1溶液中30分钟后晾干，形成橙黄色涂层。当暴露于CN?/HS?时，探针结构发生改变，引发明显的比色变化（图15）。
我们开发了基于半花青素的荧光探针PIM1，可选择性且灵敏地检测CN?和HS?离子。与CN?/HS?结合后，PIM1显示出明显的双阴离子响应，其吸收和发射特性变化有助于区分不同离子，显著提升了检测效果。
Yesudhasan Chinnaraj：负责撰写初稿、验证结果、进行正式分析及数据整理。
Muniyappan Chinnamadhaiyan：负责软件开发、实验设计和正式分析。
Abdul Majeed Kurumbala：负责软件开发。
Murugesan Rajesh：负责实验方法设计和数据整理。
Sepperumal Murugesan：负责实验方法设计和实验研究。
Jeyakumar Prabakaran：负责资源调配和实验研究。
Nagamalai Sakthi Vignesh：负责实验研究。
Balasubramaniem Ashokkumar：负责实验方法设计和实验研究。
Perumal Varalakshmi：负责资源调配和实验研究。
Manickam：...
作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
作者感谢印度泰米尔纳德邦的首席部长研究基金（CMRG，项目编号CMRG2023BIC10074和CMRG2400183）提供的资金和实验设施支持。作者Chinnaraj Yesudhasan还感谢新德里的UGC-SRF提供的奖学金。同时，作者感谢King Khalid大学科研与研究生院在大型研究项目中的支持。
Yesudhasan Chinnaraj：毕业于马杜赖卡马拉杰大学化学学院，获得硕士学位后加入该校担任初级研究员，自2018年起从事化学传感器研究工作至今。
