《International Journal of Applied Earth Observation and Geoinformation》：Effect of intranasal treatment with NAMPT-EVs on acetylated tau and cognitive function in mice with repeated controlled cortical injury
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NAMPT-EVs通过激活SIRT1减少rCCI小鼠脑内乙酰化tau蛋白，抑制神经炎症，改善脑脊液循环，从而保护神经元和认知功能。
陈伟能|吴子聪|林立山|黄森|姜秋红|黄恒|谢英春|黄龙新|李格|傅青玲|裴忠|姚晓丽
神经内科，广东省重大神经系统疾病诊断与治疗重点实验室附属第一医院；中山大学神经病学国家重点临床科室及重点学科，中国广东省广州市510080
摘要
背景
反复的创伤性脑损伤（rTBI）由于其长期对认知和行为的影响而受到越来越多的关注。研究表明，乙酰化的tau蛋白（ac-tau）是连接rTBI和阿尔茨海默病（AD）的常见病理机制，可能导致神经元死亡。因此，在本研究中，我们评估了富含烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的间充质基质细胞来源的细胞外囊泡（NAMPT-EVs）在改善反复控制性皮质损伤（rCCI）后的认知和行为障碍方面的治疗潜力。
方法
在rCCI后1个月，通过鼻内给予NAMPT-EVs，评估了Morris水迷宫和新型物体识别测试的结果。治疗后1个月，检测了Sirtuin 1（SIRT1）、ac-tau的表达、神经元损失、神经炎症、AQP4极性以及脑膜淋巴系统的形态和功能。
结果
鼻内给予NAMPT-EVs显著增加了rCCI小鼠中SIRT1的表达，从而去乙酰化tau蛋白。此外，NAMPT-EVs抑制了神经炎症，并保持了水通道蛋白-4的极性，促进了淋巴系统的功能，有利于清除脑实质中的ac-tau。值得注意的是，ac-tau的减少防止了轴突初始段的降解和tau蛋白的错误定位，从而产生了神经保护作用。
结论
NAMPT-EVs通过多种机制减少了神经元损失并改善了rCCI小鼠的认知功能。因此，NAMPT-EVs在预防rTBI后的认知缺陷方面具有潜力。
引言
创伤性脑损伤（TBI）的发病率每年约为5000万例，造成的成本约为4000亿美元[1]。最近，反复TBI（rTBI）的长期慢性影响受到了越来越多的关注，尤其是在军事人员和专业运动员中。临床上，rTBI与长期记忆缺陷相关，并显著增加了患阿尔茨海默病（AD）的风险[2]，[3]。越来越多的证据表明，这两种疾病之间存在共同的病理机制，即乙酰化[4]，[5]。此外，AD和慢性创伤性脑病患者中ac-tau蛋白的水平升高[6]，[7]。tau蛋白的乙酰化可以使其从微管上脱离并促进其聚集，从而导致早期tau病理相关的记忆丧失[8]，[9]。因此，针对tau蛋白乙酰化的治疗方法可能是rTBI和AD早期干预的有希望的疗法。
Sirtuin 1（SIRT1）是第三类去乙酰化酶家族的关键成员，在能量代谢、炎症和氧化应激中起着重要作用[10]，[11]，它是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶[12]。当SIRT1去乙酰化蛋白质底物时，NAD+分解为烟酰胺和腺苷二磷酸核糖[13]。然后，烟酰胺通过限速酶烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）[14]，[15]重新转化为NAD+，这是哺乳动物中NAD+生物合成与SIRT1活性之间的关键链接。因此，补充NAMPT可能对去乙酰化的tau蛋白有效。
清除系统，包括淋巴系统和脑膜淋巴系统，对于清除神经毒性脑蛋白至关重要[16]。临床上，血浆中的β-淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白浓度与淋巴系统和脑膜淋巴系统的功能有关[17]。值得注意的是，rTBI会损害这两个系统[18]，[19]，这可能会干扰ac-tau的清除。
细胞外囊泡（EVs）是直径40-100纳米的囊泡，富含各种细胞外基质蛋白、信使RNA和多种生长因子[20]。由于它们独特的磷脂双层结构，它们可以在体液中稳定存在并自由穿过血脑屏障。因此，EVs被设计为递送分子以治疗AD和其他神经退行性疾病[21]，[22]，[23]，并选择性地针对相关的脑部病理[24]。这种无细胞的方法是从早期专注于通过调节局部环境来修复受损大脑的干细胞移植策略演变而来的[25]。研究进一步发展了这一范式，探索了组合策略以提高治疗效果，例如将干细胞移植与二十二碳六烯酸（DHA）等支持性分子结合使用[26]。基于这一功能增强概念，我们的研究引入了一种下一代方法，通过富集NAMPT来改造外泌体（NAMPT-EVs）。这种策略将“增强”功能内置于囊泡本身，创造出一种强大且精准定位的生物制剂，超越了天然MSC-EVs的固有修复能力。
鼻内给药是一种高效、非侵入性的中枢神经系统（CNS）药物递送途径[27]，允许重复给药，并已广泛用于治疗CNS疾病的研究[28]，[29]，[30]。在本研究中，我们旨在评估作为NAMPT递送系统的鼻内给药EVs是否可以保护rTBI小鼠免受长期记忆缺陷的影响。
部分摘录
NAMPT诱导的多能干细胞来源的间充质基质细胞（iPSC-MSCs）的制备
本研究中使用的人类iPSC-MSCs按照先前的描述制备[31]，并在传代10-15代后用于后续实验。通过将HEK393T细胞与NAMPT（基因ID：10135）质粒和包装质粒共转染，并使用聚乙炔亚胺（PEI）在Opti-MEM培养基中进行包装，生成慢病毒颗粒。后续培养使用Dulbecco改良的Eagle培养基（Cytiva，美国洛根）和10%胎牛血清（FBS；Gibco，美国格兰德岛）。6小时后
NAMPT-EVs的制备和表征
图1A展示了NAMPT-iPSC-MSC和NAMPT-EVs的制备过程。我们成功建立了NAMPT-iPSC-MSCs；几乎100%的NAMPT-MSCs通过mCherry阳性染色被识别（图1B）。通过阴离子交换色谱法从MSC和NAMPT-iPSC-MSC上清液中获得了MSC-EVs和NAMPT富集的EVs。MSC-EVs和NAMPT-EVs的峰值大小分别为87纳米和98纳米（典型范围：50-200纳米）（图1C），并且被表征为双层脂质结构
讨论
NAMPT-EVs通过多种机制在rCCI小鼠模型中表现出神经保护作用，特别是通过SIRT1激活来去乙酰化tau蛋白。尽管磷酸化的tau蛋白在人类TBI中起重要作用，但在TBI后的急性期，tau蛋白的乙酰化更为显著，脑脊液中的ac-tau水平显著升高[39]。相比之下，我们在rCCI小鼠模型中观察到持续的tau蛋白乙酰化。通过减少ac-tau，鼻内给药后1个月的认知功能得到了改善
结论
我们的研究发现，鼻内给予NAMPT-EVs通过多种机制减少了ac-tau，包括增加SIRT1以去乙酰化tau蛋白，以及保护淋巴系统和脑膜淋巴系统以清除ac-tau。这些能力使其成为预防rTBI患者长期认知功能障碍的有希望的疗法。
作者贡献
W.C.、Z.P.和X.Y.：研究概念和设计；W.C.、Z.W.、Q.F.和Z.P.：方法开发和论文撰写、审阅和修订；L.L.、S.H.、H.H.、Q.J.、Y.X.和L.H.：数据获取、分析和解释以及统计分析；G.L.：技术和材料支持。所有作者均阅读并批准了最终论文。
作者贡献声明
陈伟能：撰写——初稿，项目管理，方法学，概念化。吴子聪：撰写——初稿，资源获取，项目管理，方法学。林立山：方法学，形式分析。黄森：项目管理，方法学。姜秋红：项目管理。黄恒：项目管理。谢英春：资源获取。黄龙新：方法学。李格：监督，项目管理。傅青玲：资源获取，方法学，资金支持
伦理声明
该研究获得了中山大学伦理委员会的批准。本研究中的动物实验符合ARRIVE指南 Checklist的要求。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
部分图表由田书军绘制。我们感谢所有参与这项研究的同事和朋友。本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFA1104900, 2022YFA1104904）、国家自然科学基金（编号：82401672, 82271266, 82071255, 82271448, 82271144, 81970863）、广东省重大神经系统疾病诊断与治疗重点实验室的资助
