《International Journal of Biological Macromolecules》：Optimized enzyme-microwave-assisted extraction and LC-MS/MS characterization of phycobiliproteins from the underutilized green alga
Chaetomorpha aerea
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藻蓝蛋白提取工艺优化及生物活性研究，采用酶辅助提取-微波辅助提取联合策略，通过响应面法确定最佳参数为2.08%纤维素酶、90分钟反应及270.06W微波辐射130.17秒，实现高提取效率（APC 0.269mg/mL，C-PC 0.404mg/mL，R-PE 0.346mg/mL），纯化后PI值均大于3.0，并验证其抗氧化活性及对MCF-7乳腺癌细胞的剂量依赖性细胞毒性。
作者列表：Ngoc Nhon Hoang、My Hanh Nguyen、Ngoc Hoi Nguyen、Tan Phat Nguyen、Tien T. Dang、Tuan Huu Ngoc Nguyen、Thinh Hung Nguyen、Ching Yern Chee、Dai Hai Nguyen
越南科学技术研究院先进技术研究所，TL29街1B号，安富东区，胡志明市，700000，越南
摘要
藻胆蛋白（PBPs）是一种高价值的荧光色素，广泛应用于生物医学和工业领域，但从难处理的大型藻类生物质中高效提取这些色素仍然是一个挑战。本研究建立了一种从绿色大型藻类Chaetomorpha aerea中提取和纯化PBPs的优化方案。这种藻类的细胞壁结构较为顽固，导致其生物质难以有效利用。为克服传质限制，本研究采用了双重酶辅助提取（EAE）和微波辅助提取（MAE）的方法。通过响应面方法（RSM）优化提取条件，最终确定最佳参数为：使用2.08%的纤维素酶浓度孵育90分钟，随后进行270.06瓦的微波照射130.17秒。在此条件下，藻蓝蛋白（APC）的提取量为0.269毫克/毫升，C-藻蓝蛋白（C-PC）为0.404毫克/毫升，R-藻红蛋白（R-PE）为0.346毫克/毫升。粗提取物通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤和离子交换色谱法进行纯化，纯度分别达到2.23±0.07（APC）、4.21±0.25（C-PC）和3.23±0.11（R-PE）。LC–MS/MS分析确认了纯化色素的分子身份，肽鉴定置信度≥98.5%。生物活性测试表明，纯化的PBPs具有显著的抗氧化潜力，并对MCF-7乳腺癌细胞表现出剂量依赖性的细胞毒性。这些结果表明，EAE-MAE联合策略能有效提高色素提取效率，使Chaetomorpha aerea成为功能性食品、生物技术和制药应用的可持续原料。
引言
藻胆蛋白（PBPs）是一类高荧光性的水溶性色素，在蓝细菌和红藻、蓝绿藻的光合作用系统中作为辅助光捕获结构发挥作用。这些色素具有鲜艳的自然颜色和强自荧光特性，因此在食品着色、化妆品、诊断和治疗等领域具有广泛应用价值[1][2]。根据其吸收和发射特性，PBPs主要分为藻蓝蛋白（APC）、藻蓝蛋白（PC）和藻红蛋白（PE）。由于具有高量子产率、较大的斯托克斯位移以及易于与抗体或其他生物分子标记物结合，PBPs被广泛用作流式细胞术、荧光显微镜和免疫分析中的荧光探针[3]。其强烈的稳定荧光特性还促进了串联荧光团的开发，从而实现多重检测和提高分析灵敏度。然而，分析级和生化级的PBPs纯度指数（PI）需大于3.0，这通常需要多步纯化过程，导致生产成本较高。因此，开发高效、低成本且环保的提取和纯化方法成为重要研究课题。
绿色大型藻类Chaetomorpha aerea属于枝角藻科，易于培养，生长迅速且生物量产出高。Chaetomorpha属植物含有丰富的生物活性化合物，如抗氧化剂、抗菌剂、抗真菌剂和降压剂[4][5][6][7]。在越南，C. aerea全年分布于沿海和河口生态系统，尤其是在湄公河三角洲地区。先前的研究已证实其抗氧化和抗菌潜力[8]。然而，目前仅有一小部分这种丰富的生物质被利用（例如作为动物饲料或肥料），大部分仍未得到开发。这种资源未得到充分利用不仅可能造成沿海地区的环境污染，还浪费了可转化为高价值生物产品的宝贵自然资源。
然而，从细胞内有效提取这些色素面临重大生物物理挑战。Chaetomorpha的细胞壁由难以降解的纤维素和硫酸化半乳聚糖构成，成为限制色素释放的主要障碍[8]。传统提取方法往往需要较长时间或苛刻条件，导致热敏感的PBPs降解[1][2]。为此，本研究提出了一种结合生物化学和物理方法的联合提取策略：酶辅助提取（EAE）可水解多糖网络增加细胞孔隙度，而微波辅助提取（MAE）可快速升温并产生内部压力导致细胞破裂[9]。预计这种联合方法能在温和条件下最大化PBPs的提取效率并保持其生物活性。尽管EAE和MAE已用于藻类色素提取，但现有研究大多集中在单一色素类型（如C-藻蓝蛋白（C-PC）或R-藻红蛋白（R-PE）的提取，或使用商业化的生物质来源（如螺旋藻Spirulina）或紫菜Porphyra）。关于从未充分利用的绿色大型藻类中同时提取和纯化所有三种PBPs（APC、C-PC和R-PE）的综合性数据仍十分匮乏。因此，本研究针对Chaetomorpha aerea的顽固生物质，开发了一种优化的EAE-MAE联合方案。
本研究旨在通过EAE和MAE联合方法，开发一种高效环保的方法，从Chaetomorpha aerea中同时提取和纯化三种主要藻胆蛋白（APC、C-PC和R-PE）。通过单因素实验系统优化关键参数（酶浓度、孵育时间、微波功率和照射时间），随后利用响应面方法（RSM）进一步优化提取效率。在最佳条件下获得的粗提取物经硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤和离子交换色谱（DEAE-Sepharose和Q-Sepharose柱）纯化，得到高纯度的PBPs。纯化产物经过光谱特性、功能基团和蛋白质完整性分析，并通过肽测序确认其分子身份。鉴于乳腺癌的全球普遍性及先前研究显示腺癌细胞对藻类色素的敏感性，选择MCF-7细胞系作为评估纯化PBPs细胞毒性的模型。本研究不仅建立了从Chaetomorpha aerea中高效提取PBPs的优化方案，还为这种未充分利用的藻类资源的生物技术和制药应用提供了全面的生物化学和结构信息。
部分内容摘录
生物质
从越南Tien Giang省Go Cong Dong的虾塘中采集了Chaetomorpha aerea新鲜藻样。藻样先用自来水冲洗，再用蒸馏水（DW）清洗后储存在-20°C环境中。随后在50°C的热风干燥箱中干燥至恒重。选择此温度作为温和的干燥条件，既能有效去除水分又能保持细胞内藻胆蛋白的稳定性。
提取参数对C. aerea中PBPs提取量的影响
单因素实验研究了酶浓度、酶孵育时间、微波功率和微波照射时间对C. aerea中PBPs提取效率的影响，结果如图2所示。总体而言，这四个参数均显著影响粗提取物中APC、C-PC和R-PE的含量和纯度。如图2a所示，当酶浓度达到2%（w/v）时，PBPs的提取量增加，超过该浓度后提取量不再增加。
结论
本研究成功开发了一种结合酶辅助提取和微波辅助提取的环保工艺，用于从绿色藻类Chaetomorpha aerea中同时回收APC、C-PC和R-PE。优化条件下的提取效率较高，预测值与实验值之间的偏差小于3%。通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤和离子交换色谱的顺序纯化，获得了分析级纯度的色素（PI >3.0）。
CRediT作者贡献声明
Ngoc Nhon Hoang：撰写初稿、方法设计、数据管理、概念构思。
My Hanh Nguyen：数据分析、数据管理。
Ngoc Hoi Nguyen：撰写、编辑、可视化处理、数据分析。
Tan Phat Nguyen：结果验证、资源协调。
Tien T. Dang：软件支持、数据管理。
Tuan Huu Ngoc Nguyen：结果验证、数据管理。
Thinh Hung Nguyen：结果验证、数据管理。
Ching Yern Chee：项目指导。
Dai Hai Nguyen：项目监督、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。
致谢
本研究得到了越南科学技术研究院（VAST）的支持，项目编号为NCXS01.01/24-26。
