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这篇研究揭示了被普遍认为对成体昆虫安全的昆虫生长调节剂诺瓦隆（Novaluron）对非靶标蜜蜂存在慢性毒性。通过10天亚致死浓度（2.94 ng a.i. mg–1）口服暴露实验，研究团队首次在成年意大利蜜蜂（Apis mellifera）中观察到其商用制剂Rimon Supra会导致中肠围食膜（peritrophic matrix, PM）几丁质和糖缀合物含量减少、结构紊乱、屏障通透性增加，并引发中肠上皮组织病理学改变和死亡率显著上升。这些发现强调了以几丁质合成通路为靶点的生长调节剂，即使在环境相关浓度下，也可能通过损伤关键消化器官而严重威胁重要授粉昆虫的生态健康。
1. 引言
诺瓦隆（Novaluron）是一种属于苯甲酰脲类的昆虫生长调节剂（IGR），其作用机制是干扰几丁质纤维聚合所必需的特定蛋白质的转运。它通常用于防治多种作物（如苹果、马铃薯、咖啡、甘蔗等）上的鳞翅目、鞘翅目、半翅目和双翅目害虫，尤其是在其幼体阶段。美国环境保护署（EPA）和加拿大害虫管理监管局（PMRA）都认为诺瓦隆是对非靶标昆虫毒性较低的有机磷杀虫剂的宝贵替代品。
此前，关于诺瓦隆对授粉昆虫毒性的评估主要集中在幼体阶段，尚未有显著导致成年蜜蜂死亡的报告，也缺乏其对成年蜜蜂组织毒性的数据。然而，农药对蜜蜂中肠等重要器官的影响已被广泛记录。
蜜蜂的中肠是其进行消化和营养吸收的主要器官，其肠腔由一种称为围食膜（peritrophic matrix）的无细胞、半透性同心层结构所衬里。围食膜主要由几丁质微纤维、糖胺聚糖、糖蛋白和各种蛋白质组成，由中肠的消化细胞合成。它在优化消化过程、保护上皮免受食团机械损伤以及防止微生物、毒素和其他有害物质感染方面起着关键作用。几丁质是一种由N-乙酰葡糖胺单元组成的线性多糖，约占围食膜重量的13%，其微纤维网络构成了围食膜的结构框架。
由于围食膜由在中肠中持续合成的几丁质微纤维组成，因此它可能成为昆虫生长调节剂的次要靶点。此前已在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）的幼虫中观察到，暴露于诺瓦隆后围食膜的通透性发生改变。意大利蜜蜂（Apis mellifera）是全球公认的最有效授粉昆虫之一，然而全球蜜蜂种群数量下降，农药被认为是导致这一现象的主要压力源之一。蜜蜂可能通过接触空气中的颗粒物或摄入受污染的花粉和花蜜而暴露于农药。
本研究旨在评估基于诺瓦隆的杀虫剂（商品名Rimon Supra）对成年意大利蜜蜂工蜂在慢性口服暴露下的副作用，重点关注围食膜的成分和通透性变化、中肠组织病理学以及工蜂死亡率。
2. 材料与方法
2.1. 昆虫
从巴西维索萨联邦大学（Federal University of Vi?osa, UFV）中央蜂场的三个不同蜂群中采集三个含有意大利蜜蜂蛹的巢脾，在34°C和70%相对湿度下培养24小时直至成虫羽化。将新羽化的工蜂转移至250毫升塑料罐中（每罐10只），并在32°C和70%相对湿度下维持，在开始毒理学测试前72小时提供足量的水、蜂蜜和花粉。
2.2. 杀虫剂暴露
为评估花粉和花蜜中诺瓦隆的环境残留水平是否对蜜蜂具有细胞毒性和生理影响，研究人员使用蜜蜂残留暴露（BeeREX）模型估算了环境浓度（EEC）。计算基于用于防治咖啡潜叶蛾（Leucoptera coffeella）的诺瓦隆杀虫剂Rimon Supra（有效成分100 g L–1）的最大推荐田间浓度（300 mL ha–1）。估算出的咖啡作物环境浓度为2.94 ng a.i. mg–1，此浓度被用于慢性口服暴露试验。新羽化工蜂被喂食含有该浓度诺瓦隆的50%蔗糖溶液，对照组则仅喂食50%蔗糖溶液，持续10天。
2.3. 生存分析
生存分析共使用了240只蜜蜂（120只对照组，120只处理组）。处理组蜜蜂喂食含有估算环境浓度诺瓦隆的蔗糖溶液，对照组则只喂食蔗糖溶液。在10天的慢性暴露期间，每24小时记录一次死亡率。
2.4. 组织病理学与组织化学
暴露10天后，采集蜜蜂并解剖中肠。样品经固定、脱水、树脂包埋后，切成3 μm厚的半薄切片，分别用苏木精-伊红（H&E）染色和过碘酸希夫（PAS）技术进行染色，以检测糖缀合物。使用奥林巴斯BX53显微镜进行分析和拍照。
2.5. 组织化学定量
对中肠切片进行PAS染色后，使用ImageJ/FIJI软件通过像素强度测量来定量分析围食膜中组织化学反应（糖缀合物）的强度。同时，使用“阈值”工具量化围食膜面积。
2.6. 几丁质定量
为评估诺瓦隆对几丁质合成的影响，使用与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的小麦胚芽凝集素（WGA-FITC）特异性标记N-乙酰葡糖胺，以可视化并半定量分析围食膜中的几丁质。细胞核用DAPI复染。使用荧光显微镜观察，并通过ImageJ/FIJI软件测量荧光强度。
2.7. 围食膜通透性的定性分析
为评估围食膜的通透性，将对照组和处理组的蜜蜂饥饿3小时后，喂食含有分子量为70 kDa的FITC-葡聚糖（dextran-FITC）缀合物的蔗糖溶液。1小时后解剖蜜蜂，制备中肠纵切切片，DAPI染核，使用荧光显微镜观察FITC-葡聚糖在肠腔中的分布位置。
2.8. 统计分析
使用夏皮罗-威尔克检验（Shapiro-Wilk test）评估数据正态性，使用莱文检验（Levene‘s test）评估方差齐性。糖缀合物定量和WGA-FITC荧光强度的数据使用t检验进行分析。围食膜面积数据使用曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney U test）进行分析。死亡率数据使用Kaplan-Meier估计量进行生存分析（log-rank检验），并采用Cox回归分析来估计对照组相对于处理组的生存概率。所有分析均使用Jamovi软件进行，显著性水平设为5%。
3. 结果
3.1. 存活率
与对照组相比，口服暴露于诺瓦隆杀虫剂10天的新羽化工蜂存活率显著降低。对照组存活率为87.5%，而诺瓦隆处理组降至49.2%（log-rank检验，χ2= 38.2； p < 0.001）。Cox回归分析显示，处理组蜜蜂的死亡风险是对照组的5.01倍（95% 置信区间 = 2.84 – 8.85， p < 0.01）。–1）的50%蔗糖溶液10天后的死亡率（log-rank = 38.2， p < 0.001）。">
3.2. 组织病理学
对照组的蜜蜂中肠上皮由柱状消化细胞组成，细胞核具有疏松的染色质和明显的核仁，顶端有发达的刷状缘，基底部可见再生细胞巢。肠腔内可见多层排列有序的围食膜。
暴露于诺瓦隆杀虫剂10天的蜜蜂表现出中肠上皮的组织病理学改变。部分肠道显示上皮结构紊乱，消化细胞胞质内出现大量空泡并被释放到肠腔中，细胞核出现固缩，肠腔内存在细胞碎片。更严重的病变包括细胞间连接破坏导致细胞间隙扩大，以及再生细胞巢数量减少。此外，处理组蜜蜂的围食膜呈现弥漫且无组织的状态。
3.3. 组织化学
在经诺瓦隆杀虫剂处理的蜜蜂中，PAS组织化学检测显示围食膜的染色强度显著低于对照蜜蜂（t检验， p = 0.02）。此外，与对照组相比，杀虫剂暴露组蜜蜂中肠腔内围食膜的面积也显著减少（Mann-Whitney U检验， p < 0.001）。
3.4. 几丁质定量
使用WGA-FITC特异性标记几丁质的结果显示，杀虫剂处理组蜜蜂围食膜的荧光强度显著低于对照组（t检验， p = 0.008），表明几丁质含量减少。
3.5. 围食膜通透性的定性分析
在对照组中，70 kDa的FITC-葡聚糖分子被限制在由围食膜分隔的内围食膜空间内。相比之下，在用生长调节剂杀虫剂处理10天的蜜蜂中肠中，FITC-葡聚糖分子在外围食膜空间中被检测到，该空间紧邻中肠上皮表面，这表明围食膜对该分子的通透性增加了。
4. 讨论
本研究证明，成年意大利蜜蜂工蜂口服暴露于田间相关浓度（2.94 ng a.i. mg–1）的诺瓦隆制剂Rimon Supra 10天后，中肠完整性出现显著改变。这些改变包括围食膜内糖蛋白和几丁质含量减少、组织病理学损伤以及死亡率升高。这表明，传统上被认为具有选择性、主要靶向昆虫未成熟阶段的生长抑制剂——诺瓦隆的商业制剂，在残留浓度下可对蜜蜂等非靶标成年昆虫产生显著的不利影响。
研究所用的环境浓度（EEC）是通过BeeREX模型估算的，并与田间实测值（苹果树花期处理后花粉中平均残留量为3.38 ± 0.68 ng mg–1）具有一致性，表明实验方案具有环境合理性和生态相关性。
慢性口服暴露于田间浓度杀虫剂所造成的中肠损伤，可能是观察到存活率降低的原因。处理组蜜蜂的死亡风险是对照组的5倍。这种死亡率升高很可能是持续口服暴露损害了围食膜的生产，导致上皮损伤并危及再生能力。暴露10天后，蜜蜂表现出中肠上皮的组织病理学变化，包括消化细胞胞质高度空泡化、细胞碎片释放到肠腔、核固缩、细胞间粘附丧失导致细胞间隙扩大，以及再生细胞巢丰度减少。这些变化与另一种作用模式类似的杀虫剂双苯氟脲（teflubenzuron）暴露后报道的损伤相似。
胞质空泡的增加和肠腔中细胞碎片的存在，可能表明涉及将杀虫剂代谢产生的有毒代谢物排出到中肠腔的解毒过程被激活。核固缩的发生则表明存在细胞凋亡。观察到的再生细胞巢减少可能与这些细胞分化为消化细胞有关，这是对凋亡增加和细胞损失的代偿性反应。蜜蜂中肠细胞拥有能够中和外源性化合物的分子机制，但高农药水平或长期暴露条件下，这些解毒酶系统可能超负荷，导致其活性下降。杀虫剂暴露蜜蜂肠道中观察到的形态学改变，似乎与消化细胞解毒机制无法应对杀虫剂负荷有关。
处理组蜜蜂围食膜PAS反应强度降低，表明该结构中的糖缀合物减少。围食膜是昆虫中肠的关键组成部分，其糖缀合物掺入减少很可能解释了围食膜的弥散外观及其在肠腔内占据面积的减小，这反映了基质生产的减少。这些发现表明，慢性暴露于田间浓度的诺瓦隆制剂会损害围食膜的完整性和功能，使中肠上皮更容易受到损伤、感染以及消化和营养吸收障碍的影响，从而直接影响蜜蜂的健康和生存。
围食膜中糖缀合物的减少也可能与解毒过程的能量调动有关。为了更精确地评估Rimon Supra对围食膜成分和结构的影响，研究人员使用对几丁质有高亲和力的WGA-FITC染色分析了暴露蜜蜂的中肠。分析显示处理组蜜蜂围食膜的荧光强度显著降低，这表明几丁质微纤维减少，意味着诺瓦隆通过抑制N-乙酰葡糖胺单体的聚合，影响了中肠消化细胞对这种多糖的合成。诺瓦隆与其他苯甲酰脲类杀虫剂一样，靶向位于参与几丁质丝聚合和胞吐作用的细胞内囊泡膜上的磺酰脲受体（SUR）。尽管其主要靶标是昆虫的幼体阶段，但成年蜜蜂持续摄入会干扰围食膜的更新，而围食膜是中肠细胞在整个昆虫生命周期中持续合成的结构。
Rimon Supra对成年意大利蜜蜂工蜂围食膜形成的影响，导致了该屏障通透性增加的证据，正如70 kDa FITC-葡聚糖分子的穿越所证明的那样。足够的几丁质浓度对于确保围食膜的屏障功能至关重要；因此，几丁质合成受到更大程度的抑制，会导致正常情况下会被保留在内围食膜空间的分子和颗粒的通透性增加。通过损害围食膜的结构完整性和屏障功能，基于诺瓦隆的杀虫剂可能使肠上皮暴露于病原体、毒素和消化副产品，导致生理应激、消化功能障碍和组织病理学损伤。围食膜通透性增加与意大利蜜蜂对微孢子虫（Nosema ceranae）感染、柞蚕对柞蚕微孢子虫（Nosema pernyi）感染以及鳞翅目幼虫对杆状病毒感染的更高易感性相关。
这些发现强调，即使是环境相关浓度的干扰几丁质合成的化合物，也可能对成年蜜蜂的健康和生存产生负面影响。本研究仅测试了一种亚致死浓度，尽管其具有田间相关性，但这限制了推断范围。因此，需要进一步研究评估不同环境相关浓度的影响。
5. 结论
鉴于蜜蜂作为授粉昆虫的生态重要性，以及基于其对非靶标昆虫低毒性的假设，昆虫生长调节剂作为有机磷替代品的广泛使用，我们的研究结果凸显了拓宽对这些化合物亚致死效应调查的必要性。农药的生态毒理学评估应超越死亡率，包括分析可能损害蜂群健康、行为和长期功能的形态学和生理学改变。
