基于铜死亡（Cuproptosis）调控因子的甲状腺癌生物学功能与肿瘤微环境综合分析及铜死亡相关评分系统的构建与验证

《Frontiers in Genetics》：Comprehensive analyses of biological function and tumor microenvironment with cuproptosis regulators and construction of a cuproptosis-related scoring system in thyroid cancer based on bioinformatics and experimental validation

本篇研究聚焦于甲状腺癌（THCA）中铜死亡调控因子的生物学功能与预后价值，通过生物信息学分析与实验验证，系统揭示了铜死亡相关基因（如FDX1）的表达模式、与肿瘤微环境（TME）免疫浸润的关联，并构建了一个基于机器学习（SWSFS算法）的铜死亡相关评分（RS）模型，该模型能有效预测甲状腺癌患者的无进展生存期（PFS）与无病生存期（DFS）。研究不仅深化了对铜死亡在甲状腺癌中作用机制的理解，还为临床预后评估与潜在治疗策略提供了新的生物标志物与思路。

　　

引言

甲状腺癌（Thyroid Cancer, THCA）是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升。尽管多数甲状腺癌（尤其是乳头状甲状腺癌PTC）预后较好，但部分患者仍面临复发与转移的风险。近年来，调节性细胞死亡（Regulated Cell Death, RCD）在肿瘤发生发展中的作用备受关注。铜死亡（Cuproptosis）作为一种新近发现的、由铜离子诱导的细胞死亡形式，其机制不同于凋亡、铁死亡等其他已知死亡方式。目前已有10个铜死亡相关调控基因被鉴定，包括7个正调控基因（如FDX1、LIAS等）和3个负调控基因（如CDKN2A、GLS等）。然而，铜死亡调控因子在甲状腺癌中的生物学功能与预后价值尚不明确。

材料与方法

研究整合了来自TCGA、GTEx及GEO数据库的甲状腺癌转录组数据与临床信息。通过加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）与单样本基因集富集分析（Single-sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA）探索铜死亡调控因子的生物学功能。利用滑动窗口顺序前向特征选择（Sliding Windows Sequential Forward Feature Selection, SWSFS）算法构建铜死亡相关评分（Cuproptosis-related Score, RS）模型，以预测患者的无进展生存期（Progression-Free Survival, PFS）与无病生存期（Disease-Free Survival, DFS）。通过实时定量PCR（qRT-PCR）、细胞克隆形成实验与CCK-8实验等方法，对关键基因表达及功能进行实验验证。

结果

1. 1.
   铜死亡调控因子在甲状腺癌中的表达与预后
   分析显示，多数铜死亡正调控因子（如FDX1、DLD、LIAS等）在甲状腺癌组织中表达显著低于正常组织，而负调控因子CDKN2A与GLS则高表达。FDX1的表达与较好的PFS和DFS显著相关，是一种保护性因子。生存分析进一步证实，FDX1、LIPT1等高表达与良好的生存结局相关，而CDKN2A高表达则提示预后较差。
2. 2.
   铜死亡调控因子的生物学功能与通路富集
   WGCNA与ssGSEA分析发现，铜死亡正调控因子与蛋白质分泌、氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）、MYC、MTORC1、DNA修复及脂肪生成等通路呈正相关，而与干扰素反应、炎症通路等免疫相关通路呈负相关。KEGG富集分析提示，铜死亡调控因子可能通过Rap1、PI3K-AKT、Hippo及MAPK等信号通路参与甲状腺癌的发生发展。
3. 3.
   铜死亡相关评分（RS）模型的构建与验证
   以FDX1为核心，结合铜死亡诱导剂Elesclomol的预测半数抑制浓度（IC₅₀），筛选出637个铜死亡相关基因。通过随机生存森林模型（Ranger）与SWSFS算法，最终选定6个基因（FDX1、RBPMS2、NMB、MAP1LC3A、GINM1、FAM229B）构建RS模型，其计算公式为：RS = -0.78044 × FDX1 - 0.36267 × RBPMS2 - 0.12573 × NMB + 0.08012 × MAP1LC3A + 0.35546 × GINM1 + 0.03373 × FAM229B。该模型能有效区分高风险与低风险患者，高风险组PFS与DFS显著较差。时间依赖性ROC曲线显示，RS模型对1年、2年及3年PFS与DFS的预测AUC值均高于0.6。分层分析表明，无论患者处于早期或晚期阶段、BRAF基因是否突变，RS模型均能提供有效的预后分层。此外，研究还构建了列线图（Nomogram）以直观预测患者1年及3年生存概率，校准曲线显示预测结果与实际观察值高度一致。
4. 4.
   铜死亡RS模型与肿瘤微环境免疫浸润的关联
   相关性分析发现，高RS评分与PI3K/AKT、氧化磷酸化等通路负相关，而与炎症、Hedgehog、KRAS信号通路正相关。免疫浸润分析显示，RS评分与多种免疫细胞浸润水平相关，其中效应记忆T细胞（Tem）与Th2细胞在高RS组中浸润更高，而Th17细胞则呈负相关。TIMER分析进一步揭示，FDX1表达与CD8⁺T细胞及巨噬细胞浸润显著相关，提示铜死亡可能通过调控肿瘤微环境影响甲状腺癌的进展。
5. 5.
   关键基因的实验验证与功能探索
   通过qRT-PCR验证，MAP1LC3A与RBPMS2在正常甲状腺细胞中高表达，而GINM1在甲状腺癌细胞中高表达。免疫组化（IHC）结果也支持这一发现。在甲状腺细胞中敲低FDX1后，MAP1LC3A、RBPMS2及GINM1的表达均下调，而铜死亡负调控因子GLS表达上调，提示这些基因可能受FDX1调控。然而，细胞克隆形成与CCK-8实验表明，FDX1敲低并未显著影响甲状腺细胞的增殖能力，说明FDX1在甲状腺癌中的作用可能主要通过调控铜死亡相关基因网络而非直接促进细胞生长来实现。

讨论

本研究首次系统分析了铜死亡调控因子在甲状腺癌中的表达模式、预后价值及生物学功能。FDX1作为核心调控因子，其低表达与肿瘤进展、不良预后及特定免疫微环境特征相关。通过整合多组学数据与机器学习方法构建的铜死亡RS模型，为甲状腺癌的预后预测提供了新的工具。实验验证进一步揭示了FDX1与铜死亡相关基因（如MAP1LC3A、RBPMS2、GINM1）之间的调控关系，尽管FDX1本身可能不直接驱动细胞增殖，但其在铜死亡通路中的枢纽作用值得深入探究。研究也指出，未来需通过独立临床队列验证模型的普适性，并进一步阐明铜死亡与肿瘤微环境互作的分子机制。

结论

综上所述，本研究证实了FDX1作为甲状腺癌中关键的铜死亡调控因子，通过生物信息学分析与实验验证构建了一个基于铜死亡相关基因的预后评分模型。该模型能有效预测甲状腺癌患者的PFS与DFS，并与肿瘤微环境免疫特征密切相关。研究成果不仅深化了对铜死亡在甲状腺癌中作用机制的理解，也为开发新的预后标志物与治疗策略提供了理论依据与数据支持。未来研究需进一步探索铜死亡调控因子在甲状腺癌中的具体功能机制及其临床转化潜力。