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本研究发现，未经治疗的视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）患者存在显著的肠道菌群失调和代谢异常。研究通过纵向队列分析揭示了关键的菌群与代谢物变化特征，并证实免疫抑制剂治疗超过六个月可显著减轻这些差异，使患者的肠道微生物组与健康人趋于一致。这表明肠道菌群相关生物标志物或可成为未来潜在的治疗靶点。
摘要
本研究旨在探讨视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）患者粪便微生物群的特定微生物特征和代谢组学谱，并通过一项纵向队列研究评估免疫抑制剂对其肠道菌群的影响。我们招募了21名未经治疗的NMOSD患者和21名匹配的健康对照者（HC）。采用16S rRNA基因测序和超高效液相色谱-质谱法比较组间粪便微生物组成和代谢组学谱。随后，在NMOSD患者接受免疫抑制治疗后再次收集并重新评估其粪便样本。结果发现，NMOSD患者的肠道微生物组成和代谢组学谱与HCs明显不同。NMOSD患者的α-多样性指标显著高于HCs（P <0.001）。在属水平上，NMOSD患者的微生物群改变特征表现为链球菌（Streptococcus）和瘤胃球菌（Ruminococcus）的丰度增加，以及普拉梭菌（Faecalibacterium）、雷尔氏菌（Ralstonia）和假单胞菌（Pseudomonas）的丰度降低（所有指标的线性判别分析得分均> 4，P < 0.001）。此外，通过未观察状态重建的群落系统发育调查分析发现，与HCs相比，NMOSD患者存在19种丰度差异的代谢物和44条改变的代谢通路。超过六个月的免疫抑制治疗可能会减少这些差异，使NMOSD患者的肠道菌群组成和代谢物谱更接近HCs。
引言
视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）是一种严重的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，以横贯性脊髓炎和视神经炎的反复发作为特征。尽管其病因尚不清楚，但水通道蛋白-4（AQP4）已被确定为一种疾病特异性的血清自身抗体标志物。越来越多的证据表明，环境因素在炎症和自身免疫性疾病的发病机制和进展中起着重要作用。肠道微生物群，通常被称为“第二大脑”，在生理和病理条件下可能通过肠道-微生物-脑轴影响大脑活动。肠道微生物组通过影响免疫系统和代谢通路，对这些疾病的发生有重要贡献。胃肠道微生物群的失调会影响促炎性T细胞的分化，并可能增强器官特异性的自身免疫。肠道微生物群与AQP4蛋白之间存在广泛的同源性，这揭示了NMOSD发病机制中的分子拟态。既往研究多基于横断面层面考察组间差异，可能无法完全解释治疗相关效应。为弥补这一局限，我们进行了一项病例对照研究，比较未经治疗的NMOSD患者与HCs的肠道微生物组和代谢组学谱。此外，我们还进行了纵向取样（在免疫抑制剂治疗前和治疗后六个月），以评估这些药物如何改变NMOSD患者的肠道菌群。
方法
研究设计与参与者
本研究于2021年1月至2023年6月期间从四川大学华西医院连续招募了共42名受试者，包括21名未经治疗的NMOSD患者（NT组）和21名HCs。患者被定义为“未经治疗”需满足以下两个标准之一：1）在初次诊断时未接受过免疫治疗；或2）连续使用免疫调节疗法少于六个月后停药，并保持至少六个月的无治疗洗脱期。所有患者均符合2015年国际NMOSD诊断标准，并通过基于细胞的检测确认为AQP4-IgG血清阳性。重要的是，所有患者在入组时均未接受任何免疫治疗。HCs在年龄、性别、身体质量指数（BMI）、饮食习惯和地理位置方面与患者匹配。研究排除了有急性感染、胃肠道疾病、恶性肿瘤、其他自身免疫性疾病，或在入组前一个月内服用过益生菌、抗生素或皮质类固醇的受试者。本研究使用的免疫抑制剂为吗替麦考酚酯（MMF），剂量为20-30mg/kg/天。研究获得了四川大学华西医院医学伦理委员会的批准，所有参与者在纳入研究前均提供了知情同意。
粪便样本收集和16S rRNA基因测序
所有收集的粪便样本立即在-80°C冷冻保存直至处理。解冻后，提取基因组DNA，并使用针对细菌16S rRNA基因V3-V4高变区的引物进行PCR扩增。PCR扩增子使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化，并使用Illumina TruSeq DNA PCR-Free文库制备试剂盒构建16S rRNA基因文库。
数据处理和生物信息学分析
在Illumina MiSeq平台上进行测序，所得数据使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME， v2.0）进行分析。原始序列在组装前进行质量过滤。合格的配对末端读长使用FLASH合并，然后使用UCHIME去除嵌合体。使用VSEARCH将高质量序列以≥ 97%的相似性阈值聚类为操作分类单元。使用观察到的物种数和Chao1指数评估微生物α-多样性，使用Shannon和Simpson指数评估多样性。通过基于Bray-Curtis距离的主坐标分析和置换多元方差分析评估β-多样性。进行线性判别分析效应大小分析以识别差异丰富的分类群。使用PICRUSt2预测宏基因组功能含量，并进行京都基因与基因组百科全书通路分析以识别与分类组成差异相关的代谢通路。
样本收集和代谢组学谱分析
入组时收集新鲜粪便样本，按照制造商方案悬浮于保存缓冲液中，并于-80°C冷冻保存。均质化后，取200 μL粪便样本真空干燥并重悬于800 μL甲醇中。所有样品涡旋30秒，超声处理10分钟，并在?20 °C孵育2小时以沉淀蛋白质。离心后收集上清液，真空干燥，并重悬于200 μL甲醇/水中。使用超高效液相色谱-质谱法进行代谢组学分析。通过模式识别方法分析数据集。单变量分析识别组间具有统计学显著性的特征，而多变量偏最小二乘判别分析评估受试者间变异性并突出关键区分性代谢物。对这些差异代谢物进行通路分析。
统计分析
定量数据以中位数或平均值±标准差描述。使用Mann-Whitney U检验或Student t检验比较组间变量。计算错误发现率以校正多重比较并评估筛选出的差异变量。所有分析均使用GraphPad Prism或SPSS Statistics软件进行。P值< 0.05被认为具有统计学显著性。
结果
参与者的基线特征
我们的分析包括21名未经治疗的NMOSD患者和21名匹配的HCs。从所有参与者在入组时收集了粪便样本。在这21名NMOSD患者中，有5名在免疫抑制剂治疗六个月后重新检查了粪便样本。参与者的详细人口统计学信息和临床特征见相应表格。
α-多样性
比较了未经治疗的NMOSD患者和HCs之间微生物群落结构的差异。所有α-多样性指标在NMOSD患者中均显著高于HCs，表明未经治疗的NMOSD患者肠道微生物的丰富度和多样性更高。此外，与未经治疗的患者和HCs相比，接受MMF治疗的NMOSD患者显示出α-多样性降低。
β-多样性
为比较组间粪便微生物群落结构，通过计算成对Bray-Curtis距离评估了β-多样性。基于所得距离矩阵的主坐标分析显示，未经治疗的NMOSD患者和HCs之间存在不同的聚类，沿主要轴有清晰的分离。置换多元方差分析证实了组间显著的组成差异。线性判别分析进一步确定了系统发育聚类模式。与HCs相比，特定菌属（链球菌和瘤胃球菌）在NMOSD患者中丰度显著更高，而普拉梭菌、假单胞菌和雷尔氏菌在HCs中更丰富。对IST组的比较分析显示，在免疫抑制剂治疗的NMOSD患者和HCs之间，属水平的分类学生物标志物仅存在两个显著差异。具体而言，肠杆菌在NMOSD IST组中富集，而克雷伯氏菌在HCs中显示出高丰度。
群落分析
肠道微生物群落的门水平分析显示，拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和变形菌门是未经治疗的NMOSD患者和HCs中的主要门，共同占肠道微生物群的90%以上。在属水平上，拟杆菌属、普拉梭菌属、普雷沃氏菌属、罗斯氏菌属和布劳特氏菌属是丰度最高的五个类群。
整体代谢组学分析
对来自NMOSD患者和HCs的21份粪便样本的代谢组进行了表征和比较。在多元分析中VIP得分> 1.0且单变量分析中P值< 0.05的特征被确定为最重要的代谢物。共有19种涉及氨基酸、脂质、嘌呤和维生素代谢的关键代谢物在NMOSD患者的粪便中发生了改变。D-脯氨酸、L-酪氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酸、Nω-乙酰组胺、Val-Ala、L-亮氨酰-L-丙氨酸、Val-Leu、Thr-Ile、Leu-Ile、Phe-Ile、腺苷、腺嘌呤、次黄嘌呤、亚油酸、棕榈酰乙醇酰胺、5(S)-HETE和维生素B1的水平在NMOSD粪便样本中升高。相比之下，DL-苯丙氨酸水平在NMOSD中降低。
代谢通路分析
为了基于粪便中的代谢组学数据识别具有生物学意义的模式，通过KEGG代谢库进行了通路谱分析。总共有44条与肠道微生物相关的KEGG通路在NMOSD组和HC组之间存在差异富集，其中10条在FDR校正后仍保持显著。升高的L-谷氨酸和L-酪氨酸在酒精中毒、癌症中的中心碳代谢、蛋白质消化和吸收、可卡因成瘾、氨酰-tRNA生物合成和苯丙胺成瘾中富集。同时，L-酪氨酸还与帕金森病和硫胺素代谢相关。升高的L-蛋氨酸与癌症中的中心碳代谢、蛋白质消化和吸收以及氨酰-tRNA生物合成有关。升高的腺苷与酒精中毒、帕金森病、嘌呤代谢和cAMP信号通路相关。较高的次黄嘌呤和硫胺素水平分别与嘌呤代谢和硫胺素代谢相关。此外，升高的(S)-乳酸在癌症中的中心碳代谢和cAMP信号通路中富集，而升高的腺嘌呤与嘌呤代谢相关。
免疫抑制剂对NMOSD患者肠道菌群的影响
经过六个月的免疫抑制治疗后，重新收集并分析了未经治疗的NMOSD患者的粪便样本。代谢组学分析显示，与HCs相比，接受免疫抑制剂的NMOSD患者的粪便中仅有两种关键代谢物发生改变。D-脯氨酸和油酸乙酯的水平在IST组中升高。总共有19条与肠道微生物相关的KEGG通路在IST组和HC组之间存在差异富集，包括酪氨酸代谢、柠檬酸循环、氧化磷酸化、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、丁酸酯代谢、原核生物中的碳固定、硫代谢、cAMP信号通路、GABA能突触、胰高血糖素信号通路、癌症中的中心碳代谢、丙酸酯代谢、烟酸/烟酰胺代谢、双组分系统、乙醛酸/二羧酸代谢、苯丙氨酸代谢、精氨酸/脯氨酸代谢和氯环己烷/氯苯降解。D-脯氨酸在精氨酸/脯氨酸代谢中富集，其余通路与升高的琥珀酸水平相关。
讨论
在本研究中，我们发现与HCs相比，未经治疗的NMOSD患者存在显著的肠道菌群失衡以及失调的菌群相关代谢通路。群落分析和β-多样性揭示了两组之间微生物组成的显著差异。NMOSD患者粪便微生物的α-多样性显著高于HCs，这表明肠道菌群与NMOSD发病机制之间存在潜在联系。我们的发现与之前的中国队列研究结果一致。尽管更高的微生物多样性通常有益，但在抑郁症和自闭症等疾病中也观察到了多样性和丰富度的升高。在我们的研究中，机会性病原体的过度生长（如链球菌和瘤胃球菌）是NMOSD患者肠道菌群失调的特征。先前在中国NMOSD队列中的研究也报告了与链球菌的关联。值得注意的是，链球菌丰度与疾病严重程度呈正相关。链球菌的免疫调节机制尚不清楚，但其过度存在与NMOSD患者短链脂肪酸水平降低相关，这可能增强CD4+T细胞活性和促炎反应。此外，链球菌丰度的增加可能通过升高促炎细胞因子来促进炎症。我们观察到瘤胃球菌丰度在NMOSD患者的肠道菌群中增加，尽管其机制作用有待进一步研究。瘤胃球菌是一种具有环境依赖性致病作用的厌氧菌属。该菌属在克罗恩病、炎症性肠病、脊柱关节炎和哮喘等多种疾病中富集。我们的数据还显示，NMOSD患者中有益共生微生物的消耗。作为健康人肠道中的优势细菌属，普拉梭菌通过产生短链脂肪酸和白介素-10来抑制炎症。它还增强肠道屏障完整性，抑制病原体入侵。假单胞菌和雷尔氏菌在NMOSD中的作用尚不清楚，有待研究。这些发现表明，以共生细菌减少和机会性病原体增加为特征的肠道菌群失调，可能通过炎症介质的失调导致NMOSD发病。然而，需要进一步研究来确定这种失调是引发NMOSD还是继发于该疾病。
迄今为止，人们对肠道微生物组代谢通路与NMOSD发病机制之间的潜在联系知之甚少。功能分析表明，肠道菌群的改变可能通过相关的代谢通路促进NMOSD的发展。在本研究中，粪便样本的代谢组学谱分析在未经治疗的NMOSD患者中鉴定出19种显著改变的代谢物。此外，PICRUSt分析揭示了10条与NMOSD相关的失调微生物组相关代谢通路。值得注意的是，在NMOSD患者的粪便中观察到生糖氨基酸和生糖/生酮氨基酸的水平升高。这些发现表明葡萄糖和能量代谢可能存在破坏。谷氨酸代谢先前已被报道可调节静息和活化T细胞的功能。脯氨酸是结肠上皮细胞粘液糖蛋白的关键成分，其在粪便样本中的水平升高可能表明粘蛋白合成和肠道屏障功能的改变。我们假设受损的氨基酸吸收可能导致其在肠腔中积累。最重要的是，显著富集的氨酰-tRNA生物合成通路表明NMOSD患者的氨基酸周转和蛋白质生物合成失调。我们的分析揭示了NMOSD患者粪便样本中维生素B代谢的异常。我们假设NMOSD患者粪便中硫胺素水平的升高可能通过改变肠道维生素B代谢来维持微生物的生存。然而，维生素B的免疫调节作用仍知之甚少。与嘌呤代谢相关的代谢物在NMOSD患者中失调，包括次黄嘌呤、腺嘌呤和腺苷。腺苷是调节性T细胞分泌的关键免疫抑制介质。此外，调节关键细胞过程的脂质代谢在NMOSD患者中显著改变。该通路中关键扰动的代谢物包括亚油酸、棕榈酰乙醇酰胺和5(S)-HETE。这些发现表明脂质碳链代谢与NMOSD病理学之间存在潜在联系。因此，我们的研究为肠道菌群衍生的代谢变化如何促进NMOSD发病机制提供了机制性见解。值得注意的是，代谢可能受到药物摄入的影响。在本研究中，未经治疗的NMOSD患者的肠道微生物组组成在免疫抑制治疗后与HCs非常相似，主成分分析还显示NMOSD患者和HCs之间的整体代谢谱存在显著差异。治疗后，这些患者的肠道微生物代谢物变得与HCs几乎相同。这表明代谢改变不仅可能源于疾病本身，也可能源于治疗干预。本研究的一个局限性是未经治疗的NMOSD患者队列规模较小，这限制了精确评估药物诱导的粪便代谢物变化的统计能力。未来的研究应纳入更大的未经治疗队列，以更好地区分治疗特异性的代谢转变。
结论
总之，我们的研究揭示了NMOSD患者存在肠道菌群失调和异常的代谢通路。免疫治疗可能会使NMOSD患者的肠道菌群向HCs的状态转变。这些发现不仅有助于阐明微生物组失调促进NMOSD发病的潜在机制，也为该疾病的潜在个体化治疗提供了见解。需要样本量更大、随访时间更长的进一步研究来证实我们的发现。
