《Frontiers in Immunology》：Combination of single-cell and bulk RNA-seq reveals changes in the immune landscape in osteomyelitis
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本研究整合了时间序列转录组与单细胞测序数据，首次系统性描绘了小鼠骨髓炎进程中免疫微环境的动态演变，并精准定位了驱动疾病进展的关键巨噬细胞亚群（Arg1+Sdc4+、Cxcl1+Ccl4+、Mif+Cd63+）及信号通路（Ccl3–Ccr1和Cxcl2–Cxcr2），为深入理解骨髓炎的发病机制及开发靶向免疫疗法提供了全新视角和潜在靶点。
1 引言
骨髓炎（Osteomyelitis）是由细菌或真菌等病原体引起的骨组织及周围组织的感染性炎症性疾病，是骨科领域持续的临床挑战。尽管抗感染治疗和手术技术不断进步，但其长期复发率仍高达20%，这主要归因于病原体耐药、生物膜形成以及严重的骨组织损伤等因素。免疫系统在骨髓炎的演变中扮演着双重角色：一方面作为防御感染的卫士，另一方面也可能成为骨组织损伤的潜在推手。先天免疫通过模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs），启动炎症反应，招募中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞。其中，中性粒细胞在吞噬病原体的同时，其过度活化也可能对骨组织造成附带损伤。巨噬细胞则存在促炎的M1表型和抗炎的M2表型，其极化状态影响着炎症与修复的平衡。适应性免疫，特别是Th1和Th17细胞亚群，通过分泌干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-17（IL-17）等细胞因子，在清除病原体中也起着关键作用，但过量的IL-17可能过度激活破骨细胞，导致骨破坏。传统的免疫学研究方法，如免疫组织化学、流式细胞术和酶联免疫吸附测定（ELISA），在解析免疫细胞表型、功能和相互作用网络方面存在局限。新兴的RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为高分辨率地描绘基因组和单细胞表达谱、揭示细胞异质性和动态变化提供了强大工具。本研究旨在整合群体与单细胞转录组学分析，系统描绘骨髓炎的动态基因表达景观和免疫细胞图谱，解析巨噬细胞在疾病进程中的核心调控作用，并识别潜在的治疗靶点。
2 研究方法
本研究首先对来自基因表达综合数据库（GEO）的小鼠骨髓炎时间序列数据集GSE168896进行了分析。利用FastQC和TrimGalore进行原始测序数据的质量评估与修剪，随后使用kallisto将高质量读数比对至小鼠参考基因组并进行定量。差异表达基因（DEGs）通过DESeq2鉴定，并采用模糊c均值聚类（Mfuzz R包）对动态基因进行聚类分析，以识别与疾病进展相关的基因集。免疫细胞浸润分析则通过在线工具ImmuCellAI-mouse完成。在实验层面，成功构建了小鼠骨髓炎模型，并通过苏木精-伊红（H&E）染色和微型计算机断层扫描（micro-CT）证实了模型的有效性。利用10X Genomics Chromium平台对小鼠股骨骨髓细胞进行单细胞RNA测序，数据已提交至GEO（编号GSE311208）。原始数据使用CellRanger处理，并经过严格的质量控制，包括线粒体基因百分比低于20%、每个细胞检测到的基因数在500-5000之间，并使用Scrublet去除双细胞。数据标准化和降维分析在Seurat（V5.2.0）环境中完成，细胞聚类通过均匀流形近似与投影（UMAP）可视化，并参考CellMarker 2.0数据库对细胞簇进行手动注释。为了深入探索关键细胞亚群的功能状态，研究进一步对单核/巨噬细胞进行了亚聚类分析，并使用Monocle3进行了拟时序轨迹分析以描绘其分化路径。转录因子调控网络分析通过PySCENIC流程完成，该流程利用GRNBoost算法推断转录因子（TFs）与靶基因的调控关系，并通过AUCell和SCENIC计算平均转录因子活性。细胞间通讯分析则借助CellChat（v1.6.1）R包，基于配体-受体（L-R）对的表达概率，探究了不同巨噬细胞亚型与其他免疫细胞之间的相互作用网络。
3 研究结果
3.1 骨髓炎的动态基因表达景观
对数据集GSE168896的分析显示，第1天和第3天的样本聚集在一起，而第7天和第14天的样本形成独立分支，表明存在不同的骨髓炎阶段，分别被归类为急性期和亚急性期。通过对2,382个差异表达基因进行软聚类分析，研究确定了六个具有不同时间表达模式和功能的基因簇。例如，基因簇4（C4）从第7天开始表达增加，与白细胞活化和骨化过程相关；基因簇6（C6）包含Il17a、Il23r、核因子κB受体活化因子配体（RANKL，由Tnfsf11编码）等基因，其表达呈进行性增加，表明其在骨发育和Wnt信号通路中发挥作用。免疫浸润分析进一步揭示，在第3天，巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和自然杀伤（NK）细胞显著增加，而B细胞比例则逐渐下降。
3.2 骨髓炎驱动下骨髓免疫重编程的单细胞图谱
通过单细胞测序分析，研究在小鼠骨髓样本中识别出12个主要的细胞亚群，包括巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、M2样巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs）等。其中，巨噬细胞的浸润比例在骨髓炎发生后增加最为显著，并且在所有免疫细胞中占比最高，这与群体转录组分析结果一致。
3.3 单核/巨噬细胞亚群的特征
对单核/巨噬细胞的深入分析鉴定出九个转录组学上不同的亚群。M2样巨噬细胞被进一步细分为两个亚群：高表达精氨酸酶1（Arg1）和多配体蛋白聚糖4（Sdc4）的Arg1+Sdc4+巨噬细胞，以及高表达骨桥蛋白（Ibsp）和双糖链蛋白聚糖（Bgn）的Ibsp+Bgn+巨噬细胞。研究发现，在骨髓炎发生后，Mif+Cd63+、Cxcl1+Ccl4+和Arg1+Sdc4+巨噬细胞的浸润显著增加，这一结果也得到了流式细胞术的验证。拟时序轨迹分析表明，Tmsb10+S100a4+单核细胞处于发育起点，而Arg1+Sdc4+和Mif+Cd63+巨噬细胞亚型则是充分分化的终点。
3.4 各细胞亚型的潜在调控因子分析
基于SCENIC的调控子分析揭示了各细胞类型特异性的核心转录调控网络。在Arg1+Sdc4+巨噬细胞中，ETS变异转录因子4（Etv4）和RAR相关孤儿受体A（Rora）被鉴定为最特异的调控因子；而在Cxcl1+Ccl4+巨噬细胞中，则是Etv4和V-Myb禽成髓细胞瘤病毒癌基因同源物（Myb）。
3.5 巨噬细胞亚型通过配体-受体相互作用与其他免疫细胞通讯
细胞通讯（CellChat）分析显示，Arg1+Sdc4+、Cxcl1+Ccl4+和Mif+Cd63+巨噬细胞亚型与其他免疫细胞之间具有最活跃的“外向”交互作用。CCL和CXCL信号通路是介导细胞间通讯最活跃的途径。其中，Cxcl2–Cxcr2和Ccl3–Ccr1这两对配体-受体在上述巨噬细胞亚型的通讯中贡献最大。在数据集GSE168896中，Ccl3和Cxcl2出现在基因簇4中，并且其表达随时间延长而增加，进一步提示Ccl3–Ccr1和Cxcl2–Cxcr2信号轴可能通过巨噬细胞在骨髓炎中发挥关键作用。
4 讨论与结论
本研究发现，在骨髓炎进程中，Arg1+Sdc4+和Cxcl1+Ccl4+巨噬细胞在感染后出现，而Mif+Cd63+巨噬细胞则显著增加。
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Arg1+Sdc4+巨噬细胞：高表达Arg1和Mmp12等基因。Arg1+巨噬细胞通过将L-精氨酸代谢为尿素和L-鸟氨酸，抑制一氧化氮（NO）的产生，从而缓解炎症反应。L-鸟氨酸是多胺合成的底物，有助于组织修复和再生。同时，Sdc4+巨噬细胞通过调控免疫介质的释放参与炎症调节。这些细胞在骨髓炎中的增加，可能影响着疾病消退与持续之间的平衡。
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Cxcl1+Ccl4+巨噬细胞：通过分泌趋化因子CXCL1和CCL4，招募中性粒细胞、单核细胞、T细胞等免疫细胞至炎症部位，加剧炎症反应。有趣的是，在肿瘤微环境中，这类巨噬细胞也能招募髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs），营造局部的免疫抑制环境。在骨髓炎中，它们可能通过类似的机制，在推动炎症反应的同时，也抑制过度的免疫清除。
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Mif+Cd63+巨噬细胞：巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是重要的炎症介质。CD63作为炎症表达程序的标志基因，在肝细胞癌（HCC）中与不良预后相关，并且外泌体CD63参与病原体向宿主细胞的胞内运输。该亚型在骨髓炎中显著增加，提示其可能具有促炎功能。
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关键信号通路：Ccl3–Ccr1和Cxcl2–Cxcr2信号轴被识别为巨噬细胞亚群介导细胞通讯的核心途径。Ccl3–Ccr1轴通过招募单核/巨噬细胞、中性粒细胞等到炎症部位，可能导致骨髓腔内广泛的炎性细胞浸润和持续感染，促进疾病向慢性骨髓炎发展。Cxcl2–Cxcr2轴对于宿主防御感染和组织修复至关重要，但在慢性炎症和肿瘤中，它也可能通过招募MDSCs和中性粒细胞来形成免疫抑制微环境，加剧疾病进程。
综上，本研究通过整合多组学分析，系统描绘了骨髓炎进程中复杂的免疫景观动态变化，并首次精确定位了三个关键的巨噬细胞功能亚群及其依赖的核心信号通路。这些发现不仅深化了对骨髓炎免疫病理机制的理解，也为开发针对特定巨噬细胞亚群或趋化因子信号通路的靶向治疗策略提供了新的理论依据和潜在干预靶点。未来的研究需要在临床环境中进一步验证这些发现，并探索能够改善骨髓炎患者预后的新型治疗策略。
