《Frontiers in Endocrinology》：Serum osteopontin is associated with coronary plaque vulnerability and short-term cardiovascular events: a prospective cohort study
研究背景
冠状动脉疾病（CAD）是全球范围内导致死亡的主要原因。急性冠状动脉综合征（ACS）是CAD最严重的临床表现，主要由易损性动脉粥样硬化斑块破裂引发，与心肌梗死和心源性猝死的高风险相关。因此，早期识别易损斑块对于预防主要不良心血管事件（MACE）和改善临床结局至关重要。尽管心血管影像学取得了显著进展，但在常规临床实践中可靠识别斑块不稳定性仍然具有挑战性。血管内超声（IVUS）和光学相干断层扫描（OCT）能够详细评估斑块形态，但其广泛应用受到侵入性、成本和操作依赖性的限制，这凸显了对能够补充成像技术、用于个体化风险分层和及时预防干预的简单、可重复、微创血清生物标志物的需求。
从机制角度来看，易损斑块的特点是强烈的免疫炎症活性，包括巨噬细胞浸润、促炎细胞因子释放和基质金属蛋白酶（MMPs）的激活，这些过程共同驱动细胞外基质降解和纤维帽变薄。其中，MMP-9在纤维帽失稳定中起着关键作用。虽然包括高敏C反应蛋白（hsCRP）在内的循环炎症标志物与心血管风险相关，但其有限的特异性和预测性能凸显了对与斑块水平炎症过程更直接相关的生物标志物的需求。
骨桥蛋白（SPP1）是一种由巨噬细胞、活化的T淋巴细胞和血管平滑肌细胞分泌的多功能免疫调节糖蛋白。通过整合素和CD44介导的信号传导，SPP1促进炎症细胞募集、巨噬细胞活化和MMPs的上调，从而有助于细胞外基质降解和斑块失稳定。尽管实验和横断面研究提示SPP1参与了动脉粥样硬化进展，但其作为免疫炎症性斑块易损性的上游调节因子的作用及其对短期心血管事件的预测价值尚未在前瞻性临床环境中得到充分验证。
基于以上背景，本研究假设血清SPP1升高可促进MMP-9介导的免疫炎症反应，加速动脉粥样硬化斑块的结构降解并增加斑块易损性，从而升高短期心血管风险。因此，本研究旨在比较稳定斑块和易损斑块患者之间的血清SPP1水平，研究SPP1与关键炎症介质（MMP-9、IL-6和hsCRP）之间的关联，评估SPP1对短期MACE的预测价值，并探索MMP-9在SPP1与斑块易损性关系中的潜在介导作用。
研究方法
本研究设计为前瞻性观察性队列。连续纳入在2023年2月至2024年6月期间于濮阳市油田总医院经血管造影确诊的冠状动脉疾病（CAD）患者。在基线时，所有参与者均接受冠状动脉造影及辅助血管内成像（包括IVUS或OCT），以表征冠状动脉斑块形态并对斑块易损性进行分类。随后对参与者进行为期6个月的随访，以确定主要不良心血管事件（MACE）的发生情况。
入组与排除标准
入组标准包括：年龄在40至80岁之间；根据现行国际指南临床诊断为稳定型心绞痛或急性冠脉综合征（ACS）；能够提供书面知情同意并愿意遵守研究程序。排除标准包括：存在活动性感染或在入组前4周内患有急性全身性炎症性疾病；已知恶性肿瘤或过去5年内有癌症治疗史；已确诊的自身免疫或结缔组织疾病；严重肝功能障碍（丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶>正常上限3倍）或严重肾功能障碍（估计肾小球滤过率eGFR<30 mL/min/1.73 m2）；过去3个月内近期使用过全身性免疫抑制剂或皮质类固醇治疗；以及研究者认为可能干扰研究参与或数据解释的任何其他状况。
研究变量与测量
主要关注的暴露变量是血清骨桥蛋白（SPP1）浓度，在基线时使用标准化的酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测量。其他循环炎症生物标志物包括高敏C反应蛋白（hsCRP）、白细胞介素-6（IL-6）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）。在基线评估的代谢和心血管风险参数包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和糖化血红蛋白（HbA1c）。使用根据标准公式计算的估计肾小球滤过率（eGFR）评估肾功能。
关注的临床结果有两方面。首先，根据IVUS或OCT获得的血管内成像结果，将冠状动脉斑块表型分为稳定或易损。其次，记录6个月随访期间发生的MACE。MACE被定义为包括心肌梗死、经皮冠状动脉介入治疗、心血管死亡或因心脏原因再住院的复合终点。特别注意的是，基于基线血管内成像结果进行的计划性或择期血运重建手术不计为结局事件。
影像学评估
IVUS用于评估斑块负荷、血管重塑模式以及提示富含脂质斑块成分的低回声或回声衰减区域的存在。OCT用于评估纤维帽厚度、富含脂质斑块特征、斑块表面形态以及是否存在冠状动脉内血栓。
成像定义的斑块表型（稳定与易损）采用源自既定血管内成像文献的预定、基于成像的形态学标准进行判定。对于OCT，易损斑块定义为存在薄帽纤维粥样斑块特征，其特征是富含脂质的斑块，其最小纤维帽厚度低于既定阈值，和/或其他高风险特征，如斑块破裂或冠状动脉内血栓。对于IVUS，斑块易损性的替代标志物包括大斑块负荷、不良（正性）重塑模式以及与富含脂质斑块一致的低回声或衰减区域。当两种方式都可用时，鉴于OCT更高的轴向分辨率，优先使用OCT进行基于纤维帽的易损性评估；当OCT数据不可用时，则应用IVUS标准。
所有血管内成像数据均由两名对临床特征和生物标志物测量结果不知情的有经验的心血管影像专家独立审阅。在存在分歧的情况下，通过共同审阅达成共识，必要时由第三位高级审阅员进行裁定。斑块分类和关键影像测量的观察者间可重复性已使用适当的协议统计数据进行评估，并已在补充材料中报告。
统计分析方法
连续变量采用均数±标准差表示（符合正态分布）或中位数与四分位距表示（非正态分布）。分类变量以频数和百分比表示。组间（稳定斑块与易损斑块）比较根据数据分布情况，酌情采用Student‘s t检验或Mann-Whitney U检验比较连续变量，采用卡方检验比较分类变量。
使用Pearson或Spearman相关系数（根据数据分布）评估血清SPP1水平与其他炎症生物标志物（MMP-9、IL-6和hsCRP）之间的关联。构建逻辑回归模型以评估血清SPP1与成像定义的斑块易损性之间的关联。进行受试者工作特征（ROC）曲线分析，以比较SPP1与其他炎症生物标志物的判别性能，并使用约登指数确定最佳临界值。
多变量逻辑回归和Cox回归模型的协变量是基于与冠状动脉斑块易损性和心血管事件的既定临床相关性预先指定的，并考虑了模型的简约性和过拟合风险。核心调整集包括逻辑回归模型中的年龄、性别和LDL-C，以及Cox模型中的年龄、性别、高血压和LDL-C。还额外纳入了IL-6以解释全身炎症。未应用自动化的、数据驱动的变量选择程序。
在建立多变量模型之前，使用方差膨胀因子（VIF）和容忍度统计量正式评估了炎症生物标志物之间的共线性。VIF > 5或容忍度 < 0.20被认为存在潜在的问题性共线性。当SPP1和MMP-9同时输入多变量逻辑回归模型时，两个变量都超过了这些阈值，表明存在实质性的方差共享。因此，为了避免模型不稳定和过度调整，从主要的多变量逻辑回归模型中排除了MMP-9，而保留了SPP1作为主要关注的暴露变量。
对于纵向分析，使用Cox比例风险回归模型评估基线血清SPP1水平与6个月随访期间发生的MACE之间的关联。生成Kaplan-Meier生存曲线，比较按血清SPP1水平分层的各组之间的无MACE生存期，并使用对数秩检验评估差异。
采用非参数bootstrap方法（1000次重抽样）进行中介分析，以探索MMP-9在SPP1与斑块易损性关联中的潜在介导作用。这些分析被认为是探索性和假设生成性的。还根据性别、年龄、糖尿病和高血压状态进行了预设的亚组分析。
为提高临床可解释性，额外对血清SPP1进行标准化，并分析其每增加一个标准差（SD）的影响。还进行了基于SPP1分布四分位数的分类分析，作为敏感性分析。其他敏感性分析包括SPP1的对数转换、排除异常值以及对缺失数据进行多重插补等替代建模策略，以评估研究结果的稳健性。
研究结果
基线特征与随访
研究人群的基线特征汇总如下。共纳入300名患者，其中150名根据IVUS/OCT结果被归类为有稳定斑块，150名为有易损斑块。易损斑块组的患者年龄显著更大（65.50 ± 7.15 岁 vs. 61.34 ± 7.54 岁, P < 0.001），正规教育年限更少（9.08 ± 3.22 年 vs. 10.18 ± 3.23 年, P = 0.003）。易损组的体重指数更高（27.02 ± 3.30 kg/m2vs. 25.37 ± 3.10 kg/m2, P < 0.001），病程也更长（6.22 ± 2.56 年 vs. 4.70 ± 2.00 年, P < 0.001）。
在实验室参数方面，易损斑块患者的LDL-C（3.17 ± 0.57 mmol/L vs. 2.80 ± 0.50 mmol/L, P < 0.001）、hsCRP（3.03 ± 1.19 mg/L vs. 2.11 ± 0.89 mg/L, P < 0.001）、MMP-9（395.55 ± 61.18 ng/mL vs. 296.69 ± 53.62 ng/mL, P < 0.001）、IL-6（6.91 ± 1.71 pg/mL vs. 4.84 ± 1.47 pg/mL, P < 0.001）和HbA1c（6.38 ± 0.67% vs. 5.92 ± 0.62%, P < 0.001）水平更高，而HDL-C显著更低（1.01 ± 0.21 mmol/L vs. 1.11 ± 0.28 mmol/L, P = 0.002）。估计肾小球滤过率在组间无显著差异。在药物使用方面，接受他汀类药物（56.7% vs. 53.3%）或血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素II受体阻滞剂（ACEi/ARB）治疗（64.0% vs. 58.7%）的患者比例无显著差异。易损组的平均SPP1浓度为55.85 ± 12.26 ng/mL，而稳定组为39.18 ± 9.42 ng/mL。
在为期6个月的随访期间，共记录了36起MACE，包括8例心肌梗死、14例非计划性或临床驱动的经皮冠状动脉介入治疗、3例心血管死亡和11例心脏原因再住院。
血清SPP1与炎症标志物的相关性
在调整了年龄、性别和LDL-C的多变量线性回归分析中，血清SPP1水平与MMP-9（β = 0.71, 95% CI: 0.64–0.78; P < 0.001）、IL-6（β = 0.42, 95% CI: 0.34–0.50; P < 0.001）以及程度较轻的hsCRP（β = 0.08, 95% CI: 0.02–0.14; P = 0.009）独立相关。相关性分析表明，血清SPP1水平与炎症介质呈强正相关。
成像定义斑块易损性的逻辑回归分析
在单变量逻辑回归分析中，较高的血清SPP1、MMP-9和IL-6水平均与成像定义的斑块易损性几率增加显著相关（所有P < 0.001），而hsCRP和LDL-C与斑块易损性无显著相关（分别为P = 0.091和P = 0.824）。
在调整了年龄、性别、LDL-C和IL-6的多变量逻辑回归模型中，血清SPP1仍然与斑块易损性独立相关（OR 1.08, 95% CI 1.05–1.11; P < 0.001）。LDL-C也显示出适度但具有统计学意义的关联（OR 1.36, 95% CI 1.03–1.80; P = 0.032），而IL-6在调整后不再具有统计学意义（P = 0.122）。年龄和性别在调整后的模型中与斑块易损性无独立关联（两者P > 0.05）。
在进一步调整了主要心脏代谢风险因素和药物使用（包括BMI、糖尿病、当前吸烟状况、HDL-C、HbA1c、他汀类药物使用和ACEi/ARB使用）的扩展多变量逻辑回归模型中，血清SPP1与成像定义斑块易损性之间的关联仍然稳健且具有统计学意义。
预测MACE的Cox回归分析
使用Cox比例风险模型评估血清生物标志物对6个月MACE的预测价值。在单变量分析中，较高的SPP1、MMP-9和IL-6水平与MACE风险增加显著相关。具体而言，SPP1显示出最强的关联（HR 1.47, 95% CI: 1.23–1.76, P < 0.001），其次是MMP-9（HR 1.31, 95% CI: 1.11–1.55, P = 0.001）和IL-6（HR 1.25, 95% CI: 1.05–1.50, P = 0.011）。hs-CRP不能预测MACE（P = 0.262）。在调整了年龄、性别和高血压的多变量模型中，SPP1仍然是6个月MACE的独立预测因子（HR 1.35, 95% CI: 1.11–1.64, P = 0.002）。相比之下，MMP-9和IL-6与MACE的关联性减弱且不再具有统计学意义（两者P>0.05）。
在进一步调整了主要心脏代谢风险因素和药物使用（包括BMI、糖尿病、当前吸烟状况、HDL-C、HbA1c和他汀类药物使用）的扩展多变量Cox比例风险模型中，基线血清SPP1仍然与6个月MACE风险增加独立相关。
血清SPP1表达为每标准差增加和按四分位数的关联
为提高临床可解释性，当对血清SPP1进行重新参数化时，基于标准差增加和分布四分位数的分析得出了与主要每单位模型一致的结果。在基于四分位数的分析中，与最低SPP1四分位数相比，最高四分位数的参与者表现出斑块易损性风险（OR = 2.74, 95% CI 1.78–4.23, P < 0.001）和6个月MACE风险（HR = 2.36, 95% CI 1.38–4.04, P = 0.002）的显著增加，且效应估计值在较高的四分位数中呈现清晰的梯度增加。这些发现表明血清SPP1水平与斑块不稳定性和短期心血管风险之间存在剂量反应关系。
调整肾功能后的敏感性分析
为排除肾功能潜在的混杂影响，进行了纳入基线估计肾小球滤过率（eGFR）的敏感性分析。在评估成像定义斑块易损性的逻辑回归模型中，将eGFR纳入多变量模型后，血清SPP1水平与斑块易损性之间的关联仍然具有统计学意义（每单位增加OR=1.07; 95% CI, 1.04–1.10; P < 0.001），与主要模型相比衰减最小。基线eGFR本身与斑块易损性无独立关联（P = 0.318）。
同样，在针对6个月MACE的Cox比例风险模型中，额外调整eGFR并未实质性地改变SPP1与MACE发生之间的关联（每单位增加HR=1.33; 95% CI, 1.09–1.62; P = 0.004）。肾功能在完全调整后的模型中并非MACE的显著预测因子（P = 0.176）。
预测斑块破裂的ROC曲线分析
进行了受试者工作特征（ROC）曲线分析，比较血清生物标志物在区分易损斑块与稳定斑块方面的诊断性能。在所有测试的标志物中，SPP1表现出最高的诊断准确性，曲线下面积（AUC）为0.875（95% CI: 0.837–0.913）。相比之下，IL-6（AUC = 0.786, 95% CI: 0.736–0.836）和MMP-9（AUC = 0.729, 95% CI: 0.673–0.786）的准确性较低，而hs-CRP表现出较差的判别能力（AUC = 0.559, 95% CI: 0.491–0.625）。使用DeLong‘s检验对ROC曲线进行成对比较表明，SPP1的AUC显著高于IL-6、MMP-9和hsCRP。
Kaplan-Meier生存分析
Kaplan-Meier生存曲线显示，按血清SPP1水平分层的患者之间，累积无MACE生存期存在显著差异。患者根据研究人群血清SPP1浓度的中位数（中位值：47.0 ng/mL）被分为高SPP1组和低SPP1组。在6个月的随访期间，高SPP1组患者MACE的发生率高于低SPP1组。无事件生存曲线的分离在随访早期即被观察到，并随时间推移变得更加明显，到随访结束时，高SPP1组的无MACE生存率下降至70%以下。根据对数秩检验，组间差异具有统计学意义（P = 0.004）。
中介分析
为进一步探索SPP1与斑块破裂之间的机制通路，使用bootstrap方法进行了中介分析。SPP1对斑块破裂的总效应显著（估计值 = 0.423, 95% CI: 0.271–0.576, P < 0.001）。其中，通过MMP-9介导的间接效应占0.187（95% CI: 0.072–0.318, P < 0.01），占总效应的44.2%。SPP1对斑块破裂的直接效应仍然显著（估计值 = 0.236, 95% CI: 0.065–0.407）。
亚组分析与敏感性分析
较高的血清SPP1与斑块破裂和6个月MACE之间的关联在不同性别、年龄、糖尿病、高血压、LDL、他汀类药物使用、吸烟和BMI亚组中是一致的。效应大小具有可比性，且无显著的交互作用（所有交互作用P > 0.3）。
当对SPP1进行对数转换、在ROC最佳临界值或中位数处进行二分类、在剔除异常值或对缺失数据进行插补后，结果仍然稳健。调整MMP-9和IL-6会减弱但并未消除这种关联。SPP1在各种设定下（包括对数转换、二分类、限制在他汀使用者中的模型、逆概率处理加权和多重插补）均能一致地预测6个月MACE。采用不同的终点定义也得出了相似的结果，比例风险假设得到满足。
讨论与结论
在这项针对经IVUS/OCT进行斑块表征的血管造影确诊CAD患者的前瞻性队列研究中，系统地评估了血清SPP1与成像定义的斑块易损性及短期心血管事件的临床相关性。研究发现，血清SPP1水平在易损斑块患者中显著更高，并且与关键炎症介质，特别是MMP-9和IL-6密切相关。多变量逻辑回归分析表明，SPP1与斑块易损性独立相关，ROC分析显示其判别性能优于传统炎症标志物。此外，在Cox回归和Kaplan-Meier分析中，SPP1水平升高与6个月MACE发生率增加持续相关。中介分析进一步提示MMP-9部分介导了SPP1与斑块易损性之间的关联。这些发现共同支持血清SPP1作为一个反映免疫炎症性斑块易损性及其与后续短期心血管事件相关的临床相关生物标志物。
本研究的优势包括前瞻性队列设计、血管内高分辨率成像与生物标志物测量的整合以及纵向随访。然而，研究也存在一些局限性，包括单中心、中等样本量、随访时间相对较短、事件数量较少，以及斑块分类存在一定主观性。未来需要在更大规模、多中心、更长随访期的队列中进行验证，并开展实验研究以阐明SPP1–MMP-9通路的生物学机制。
总之，在这项前瞻性队列研究中，血清SPP1水平升高与冠状动脉疾病患者的成像定义斑块易损性和短期主要不良心血管事件独立相关。SPP1的判别性能优于传统炎症标志物，且中介分析提示MMP-9部分参与了这种关联。这些发现支持血清SPP1作为反映斑块易损性和短期心血管事件的临床相关生物标志物，值得在更大规模的研究中进行进一步验证。
