《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Co-detection and genomic characterization of avian rotavirus A, avian orthoreovirus, and chicken megrivirus-C using nontargeted metagenomic surveillance in Indian broiler chickens
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本研究采用非靶向下一代测序技术，对印度东北部阿萨姆邦肉鸡群肠道病毒组进行监测，首次在同一粪便样本中共同检测并完成基因组特征分析，揭示了禽轮状病毒A型、禽正呼肠孤病毒和鸡巨病毒-C型三种病毒的共存情况。研究通过系统发育分析和单核苷酸多态性鉴定，发现病毒基因组存在重配驱动的进化特征及非同义突变，为区域性病毒多样性监测、疫苗策略优化和生物安全防控提供了重要基因组基线数据。
1 引言
家禽肠道病毒组包含一系列常在亚临床或共感染状态下存在的病毒，对家禽健康监测和疾病控制构成挑战。禽轮状病毒A型和禽正呼肠孤病毒已在全球商业家禽中造成显著经济损失，而鸡巨病毒-C型虽在家禽肠道病毒组中频繁检出，但其致病作用和经济影响仍不明确。这些病毒均具有肠道嗜性，通过粪口途径传播，可引起腹泻、脱水、饲料效率降低等临床症状，尤其影响幼禽。其中，禽轮状病毒A型是肉鸡肠炎和矮小综合征的主要病因，禽正呼肠孤病毒则可导致全身性感染，表现为病毒性关节炎、腱鞘炎和肠道吸收不良，而鸡巨病毒-C型则与肠道健康和生长性能受损有关。病毒共循环和共感染在家禽中十分常见，可能加剧疾病后果并削弱疫苗反应。
禽轮状病毒A型属于Sedoreoviridae科，其分段双链RNA基因组包含11个节段，编码六个结构蛋白和多个非结构蛋白。轮状病毒分类工作组根据所有11个基因组节段序列来命名基因型，其遗传多样性主要源于共感染病毒株之间的重配以及罕见的节段内重组。禽正呼肠孤病毒属于Spinareoviridae科，其无包膜病毒颗粒具有双层衣壳，包裹着10个节段的双链RNA基因组，编码8个结构蛋白和4个非结构蛋白。基于σC基因序列变异性，禽正呼肠孤病毒被分为六个公认的基因型簇，S1节段是重组热点。鸡巨病毒-C型属于Picornaviridae科，其正义单链RNA基因组编码一个被切割成结构蛋白和非结构蛋白的多聚蛋白。其分类基于P1衣壳区以及2C和3C-D组合区的氨基酸序列分析，其中基因型C1是全球报告最多、地理分布最广的。
本研究是更广泛的基于非靶向下一代测序计划的一部分，旨在绘制印度、中东、土耳其和非洲地区禽类病毒病原体图谱，以生成指导疫苗接种策略、加强生物安全措施的基因组数据。在此框架下，我们报告了在印度东北部三个商业肉鸡场的临床样本中，上述三种遗传学上不同的肠道病毒的完整基因组。
2 材料与方法
2.1 采样地点和鸡群信息
样本采集自印度东北部阿萨姆邦Kamrup Rural地区的三个商业肉鸡场。采样时，所有鸡群均表现出高死亡率和低于标准的体重。三个农场的鸡群分别有10.6%、25.4%和14.4%的累计死亡率，且33日龄鸡只的体重远低于区域标准。尸检发现肾脏苍白肿大、肝脏肿大、输尿管扩张并有尿酸盐沉积。
2.2 临床样本的收集与实验室处理
为经济高效地最大化病原体检测和核酸回收，每个农场50只肉鸡的泄殖腔拭子被汇集为农场水平的混合池。为了安全运输和保存核酸，将三个池的等体积样品点在基于滤膜的AniCard上并干燥。随后使用Kylt?RNA/DNA纯化试剂盒提取总核酸，并应用专有的宿主DNA/RNA去除方案以富集病毒RNA。
2.3 下一代测序
提取的RNA进行浓度和质量评估后，使用随机引物和逆转录酶合成cDNA。构建测序文库后，在Illumina MiSeq平台上进行双端测序。
2.4 序列组装与注释
原始测序读数进行质量修剪和宿主来源读数的过滤。剩余的读数使用MEGAHIT进行de novo组装，使用Geneious Prime?软件进行开放阅读框和功能基因组元件的注释。
2.5 系统发育分析
使用MAFFT对序列进行比对，并在MEGA X中使用最大似然法推断系统发育树，通过1000次自举重复评估关系的稳健性。
2.6 重组分析
使用RDP4软件中的八种启发式重组检测算法，对印度禽轮状病毒A型、禽正呼肠孤病毒和鸡巨病毒株的重组事件进行评估。
3 结果
3.1 NGS读数的组成和分类学分类
非靶向下一代测序产生了137,968个质量过滤后的读数对。其中，禽轮状病毒A型、禽正呼肠孤病毒和鸡巨病毒-C型分别占6.41%、5.37%和0.67%。
3.2 鸡巨病毒-C型
组装出完整的鸡巨病毒-C型基因组，被命名为ChMeV-C/broiler/IN/A2323728-003/23。该基因组包含5′和3′非翻译区、多聚蛋白编码区和推测的ORF2。氨基酸比较显示其与来自多个地理区域的参考菌株高度相似。在次要病毒群体中检测到五个非同义单核苷酸多态性，涉及VP0、VP1、ORF2和RNA依赖性RNA聚合酶3D。基于P1区和2C与3C-D组合区的氨基酸序列的系统发育树将该印度菌株置于MeV-C进化枝内，形成了一个独特的、高支持度的亚系。
3.3 禽正呼肠孤病毒
禽正呼肠孤病毒特异性读数被组装成10个代表完整基因组节段的gap-free contig，命名为Reo/broiler/IN/A2323728-003/23。基因组节段长度与已发表的编码序列大小一致。在次要病毒群体中发现了九个非同义单核苷酸多态性，涉及多个节段的关键蛋白质。BLASTp分析显示，大多数节段与匈牙利的GCIII菌株高度相似，而S1节段编码的p10、p17和σC蛋白则与GCIV菌株聚在一起。基于σC氨基酸序列的系统发育分析将该印度菌株置于GCIV内，与中国和日本菌株形成了一个强支持度的独立亚群。
3.4 禽轮状病毒A型
禽轮状病毒A型特异性读数被组装成11个代表完整基因组节段的gap-free contig，获得了高覆盖深度。根据轮状病毒分类工作组的标准，该印度菌株的基因型被鉴定为G19–P[31]–I11–R6–C6–M7–A16–N6–Tx–E10–H8，并被命名为AvRV-A/broiler/IN/A2323728-003/23/G19P[31]。系统发育分析证实了该菌株的基因型分配。在次要病毒群体中鉴定出八个单核苷酸多态性，包括三个非同义替换。
3.5 重组分析
使用RDP4未在任何印度禽轮状病毒A型、禽正呼肠孤病毒或鸡巨病毒株的基因组节段中检测到可信的节段内重组事件。
4 讨论
本研究证实了在印度东北部商业肉鸡群中三种不同肠道病毒的共循环。尽管检测到的传染性法氏囊病病毒主要是淋巴嗜性的，但其同时存在表明鸡只暴露于免疫抑制和肠道病原体，这种组合可能加剧易感性并调节病毒脱落。鸡群水平记录显示死亡率升高和生长性能下降，表明在研究的鸡群中存在持续但很大程度上未被识别的病毒传播。混合取样虽然成本效益高，但缺乏个体水平的分辨率，无法确定每种病毒对鸡群健康的具体贡献。
这是印度首批完整的鸡巨病毒-C1基因组报告之一，为其在全球鸡群中的广泛检测提供了证据。在次要等位基因中发现的非同义突变表明持续的进化动态。印度鸡巨病毒-C菌株与欧洲、南美和非洲菌株形成独特亚系的系统发育位置，表明了全球分布的C1基因型内的区域性多样化。
印度禽正呼肠孤病毒菌株的基因组特征突出了在集约化商业家禽系统中禽正呼肠孤病毒进化的复杂性。跨多个基因组节段的系统发育不一致表明该印度菌株构成了一个基因组镶嵌体，这可能影响抗原性和毒力，使疫苗设计复杂化。检测到的九个非同义次要等位基因单核苷酸多态性可能反映了田间分离株之间新兴的功能差异。大多数获得许可的禽正呼肠孤病毒疫苗与印度分离株等不同菌株的抗原重叠有限，这强调了需要根据区域信息更新疫苗并加强基因组监测。
本研究中鉴定的印度禽轮状病毒A型菌株的基因型与德国和巴西家禽菌株报告的构型相似，表明在地理上分散的禽轮状病毒A型菌株中存在保守的基因组骨架。然而，几个节段（包括NSP3）的系统发育独特性可能反映了在其他保守基因型内的区域性多样化。观察到的单核苷酸多态性表明潜在的宿主适应或纯化选择放松。印度禽轮状病毒A型菌株的遗传独特性和进化变化迹象，凸显了为保障家禽健康而持续进行区域性基因组监测和疫苗知情干预的必要性。
5 结论
本研究首次记录了在经历健康和性能挑战的印度肉鸡群中禽轮状病毒A型、禽正呼肠孤病毒和鸡巨病毒-C型的共循环和完整基因组分析。即使在接种疫苗的鸡群中检测到遗传多样化的肠道病毒，也凸显了生产系统中病毒循环的复杂性。观察到的变异，包括非同义多态性和不同的系统发育聚类模式，表明存在具有潜在毒力、宿主适应和疫苗效力影响的持续微进化。宏基因组非靶向下一代测序仍然是揭示病原体多样性、表征新兴变异和为区域特异性控制策略提供信息的重要工具。在高密度家禽生产区持续进行基因组监测对于早期发现变异和降低疫苗失效风险至关重要。
