基于经典遗传与分子标记技术的“La Brillante”生菜品种对黑根腐病双病原体抗性的单基因显性遗传解析

《Euphytica》：Inheritance of resistance to Berkeleyomyces rouxiae and Berkeleyomyces basicola in the lettuce cultivar La Brillante

该研究针对在巴西等热带地区严重危害生菜的黑根腐病（由Berkeleyomyces basicola和B. rouxiae引起），旨在阐明优良抗源生菜品种‘La Brillante’对该复合病原体的抗性遗传规律。研究表明，该品种对两种病原体的抗性均受单显性基因控制（F2群体符合3:1分离比），揭示了其在育种应用中简单高效的遗传基础，为培育抗病生菜品种提供了关键理论依据。

　　

在热带地区的生菜种植区，一种名为黑根腐病（Black root rot）的病害正悄然蔓延，成为制约生产的主要难题。这种病害由两种真菌引起——Berkeleyomyces basicola和B. rouxiae（两者以前统称为Thielaviopsis basicola）。它们不仅会单独侵染，在巴西的全国性调查中还被发现具有重叠的地理分布和相似的发病水平。被感染的生菜根系腐烂、植株矮化、萎蔫，严重时甚至整体枯死，还可能与其他土传病原体如根结线虫和多种真菌协同为害，导致损失加剧。传统的栽培和化学防治手段不仅成本高昂，而且常常效果不佳。面对这种情况，利用具有内在抗性的生菜品种成为了最可持续、最有前景的管理策略。然而，尽管过去已有一些研究探索过对B. basicola的抗性，但对于新近发现的近缘物种B. rouxiae的抗性遗传规律，科学界尚一无所知。因此，为了给育种项目铺平道路，搞清楚抗性是如何传递给后代的，就成为了一项关键而迫切的任务。发表在《Euphytica》上的这项研究，正是瞄准了这一知识空白，聚焦于一个名为‘La Brillante’的老品种。该品种展现出对Berkeleyomyces属两种真菌的广谱高抗性，是育种的宝贵材料。本研究旨在阐明‘La Brillante’对B. basicola和B. rouxiae的抗性遗传模式，为高效将这些抗性基因导入优良生菜品系提供科学依据。

为开展研究，研究人员主要采用了遗传杂交与群体分析、分子标记辅助鉴定以及人工接种与抗性表型鉴定这几项关键技术。研究地点设在巴西利亚的巴西农牧业研究公司蔬菜作物中心（Embrapa Vegetable Crops）。研究人员首先以高感病品种‘Elisa’作为父本，与抗病品种‘La Brillante’（母本）进行人工杂交。由于生菜花的闭花授粉特性，自交率较高，为了确保获得的F₁代是真正的杂交种而非自交后代，他们利用RAPD（随机扩增多态性DNA）分子标记对亲本和F₁代植株进行了基因分型，筛选出具有父本特异性条带的真正F₁植株。随后，将两个真正的F₁植株自交，获得了两个独立的F₂分离群体。对于抗性评估，研究人员制备了高浓度的病原菌孢子悬浮液（2×10⁶个孢子/mL），采用了一种严格的接种方案：将21天苗龄的幼苗根系浸入孢子液，然后移栽到已预接种病原菌的基质中，以此模拟高强度的病害压力。在接种30天后，根据根部症状的严重程度，采用1-5级病情指数进行评分，并将评分为1-2级的植株定义为抗病（R），3-5级的定义为感病（S）。最后，通过卡方检验分析F₂群体中抗、感植株的分离比例，以判断是否符合孟德尔遗传规律。

研究结果

RAPD标记筛选与F₁杂交植株的基因型鉴定：研究人员筛选了48个RAPD引物，最终选择OP-H7引物，因为它能在父本‘Elisa’中稳定产生一条特异性条带，而在母本‘La Brillante’中缺失，从而能够有效区分杂交后代。通过此标记鉴定出的24个真正F₁杂种植株，在接种B. rouxiae或B. basicola后均未表现出任何症状（病情指数为1），这表明对这两种病原菌的抗性均为显性。

接种两种Berkeleyomyces物种的F₂群体中抗病/感病性状的分离模式**：这是研究的核心发现。研究分别评估了F₂群体对两种病原体的反应。

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  对于B. rouxiae：在接种的247株F₂植株中，173株表现为抗病（占70.04%），74株感病（占29.96%）。
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  对于B. basicola：在接种的166株F₂植株中，134株表现为抗病（占80.72%），32株感病（占19.28%）。
  卡方检验表明，两个F₂群体的抗感分离比均与3:1的预期值拟合良好。这意味着抗性由单个显性基因控制。图片直观地展示了亲本‘Elisa’（感病）、‘La Brillante’（抗病）以及一组F₂幼苗在接种30天后的症状差异，感病植株根部维管组织呈暗褐色2 seedlings (30 days after inoculation with two Berkeleyomycesspecies). Panel A: Plants inoculated with an isolate of B. rouxiae. Panel B: plants inoculated with B. basicola. The susceptible reaction is visualized by the presence of dark brown vascular tissue of the root tissues. Brasília-DF, Brazil, 2022">。

结论与讨论

本研究首次系统报道了生菜对Berkeleyomyces属两种病原菌（B. basicola和B. rouxiae）抗性的遗传规律。核心结论是：生菜品种‘La Brillante’对这两种病原菌的抗性均由单个显性基因控制，且该性状具有高度的外显率和表型稳定性。

研究的重要意义体现在多个层面：

1. 1.
   简化育种策略：单显性基因控制的抗性意味着在育种程序中易于追踪和选择，可以高效地将这些抗性性状整合到优良的生菜育种系和品种中。
2. 2.
   应对复合病原体：由于B. basicola和B. rouxiae在田间往往重叠发生，培育对两者均具抗性的品种是实现持久有效防治的关键。‘La Brillante’提供了这样一个宝贵的广谱抗源。
3. 3.
   为基因定位和克隆奠定基础：明确抗性为单基因控制是后续进行基因定位、克隆和功能研究的第一步。未来的研究需要通过构建更大的分离群体或利用分子标记来验证控制对两种病原体抗性的基因是否为同一个位点，或者是由两个紧密连锁或独立的基因控制。同时，也有必要探究‘La Brillante’中的抗性基因与之前报道的、来源于另一抗源品种‘PI 342444’（Tinto）的抗T. basicola（旧称）基因Tb是否为同一基因。
4. 4.
   综合农艺价值：‘La Brillante’本身还是一个多抗性资源库，已知对霜霉病、黄萎病、番茄斑萎病毒等多种病害具有抗性，而父本‘Elisa’则抗莴苣花叶病毒。因此，通过‘La Brillante’和‘Elisa’杂交产生的后代，不仅是抗黑根腐病的优良材料，也是聚合多种抗病基因、培育适应热带亚热带地区复杂病害环境生菜品种的理想起点。这项研究为全球生菜育种项目，特别是在黑根腐病流行地区，提供了至关重要的遗传学信息和实用的育种亲本材料。