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面对抗生素耐药性日益严重的单核细胞增生李斯特菌感染，研究人员开创性地利用CRISPR-Cas9技术对商用益生菌S. boulardii进行基因工程改造，使其在基因组中稳定整合并分泌噬菌体内溶素Ply511。该研究通过模拟胃肠道消化、简化肠道菌群（SIHUMI-L）模型以及人体粪便样本的体外发酵实验，证实了工程化酵母及其提取物能有效且特异性地抑制李斯特菌，同时减少对肠道共生菌群的影响，为开发靶向性、不干扰微生物组的抗感染新策略提供了概念验证。
每逢夏秋之际，一些由食物引起的感染便会悄然流行，其中，由单核细胞增生李斯特菌引起的李斯特菌病（Listeriosis）尤为棘手。这种食源性病原体不仅会导致发热性胃肠炎，还可能入侵中枢神经系统引发脑膜炎，造成严重后果甚至死亡。更令人担忧的是，随着抗生素在全球的广泛应用，李斯特菌的耐药克隆株不断出现，而抗生素治疗本身也可能带来破坏肠道菌群平衡的副作用。面对这一双重挑战，科学家们亟需寻找新的武器，既能精准打击病原体，又能保护好我们体内宝贵的共生微生物群落。于是，一项发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上的研究，将目光投向了我们熟悉又陌生的“盟友”——益生菌。
本研究正是为了解决这一难题而展开。研究人员设想，能否将一种高效的“细菌切割器”——噬菌体内溶素（Endolysin，也称酶性杀菌剂）——装载到一种安全的“运输车”上，直接将其递送到感染发生的“前线”，即我们的肠道？他们选择的“运输车”是布拉迪酵母（Saccharomyces boulardii），这是一种已经商业化、常被用来缓解抗生素相关腹泻的益生酵母，其真核特性使其不受抗生素影响。而他们搭载的“武器”，则是一种名为Ply511的噬菌体内溶素，它对所有血清型的李斯特菌都有活性，且理论上特异性极高，有望在消灭“坏蛋”的同时，不伤及肠道里的“好公民”。
为了开展这项研究，研究者运用了几个关键技术方法。首先，他们采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将编码Ply511的分泌表达盒以无痕、无抗生素抗性标记的方式，精准整合到布拉迪酵母的三个染色体位点，构建出能稳定分泌活性内溶素的工程菌株。其次，他们建立了一套多层次的体外评估体系：(1) 模拟胃肠道消化实验：使用INFOGEST标准方法，评估工程化酵母在模拟胃酸、肠液环境中的活性和对李斯特菌的抑制效果；(2) 简化人类肠道菌群模型（SIHUMI-L）：引入了一个包含七种代表性人类肠道细菌和靶病原体的可控细菌联盟，用以评估内溶素的特异性；(3) 基于人类粪便样本的体外肠道发酵模型：采集了三位健康志愿者的粪便，在模拟小肠的微氧环境中，真实评估工程化酵母在复杂肠道菌群竞争下的抗病原体效果。所有实验中李斯特菌活菌的定量均采用平板计数法，而酵母及肠道菌群成员的定量则通过物种特异性的定量PCR（qPCR）进行。
研究结果部分，作者通过一系列实验系统地验证了工程化酵母的效能。
S. boulardii 分泌Ply511并展示酶活性
研究人员成功利用CRISPR-Cas9技术，将包含Sed1启动子、Sed1分泌信号肽、Ply511编码序列和Sag1终止子的表达盒整合到布拉迪酵母基因组中。通过在含有热灭活李斯特菌细胞层的平板上进行点板实验，他们证实了工程化的布拉迪酵母能够分泌具有活性的Ply511，在菌落周围形成透明的水解圈，表明其能够降解李斯特菌的肽聚糖细胞壁。值得注意的是，与同样经过改造的酿酒酵母（S. cerevisiae）相比，布拉迪酵母展示的水解圈略小，提示其内溶素的分泌表达水平可能较低。
酵母提取物在SIHUMI群落中特异性抑制李斯特菌
研究者测试了不同酵母菌株的细胞提取物对在简化肠道菌群（SIHUMI-L）中生长的李斯特菌的影响。结果发现，无论是酿酒酵母还是布拉迪酵母的工程化提取物，都能有效降低李斯特菌的数量。其中，来自工程化酿酒酵母的提取物抗李斯特菌活性最强，可在24小时内将李斯特菌降至检测限以下。更重要的是，通过qPCR追踪SIHUMI群落中其他六种细菌的基因组拷贝数，他们发现酵母提取物（无论是否含有Ply511）的添加，并未显著影响这些共生菌的丰度，证实了Ply511对李斯特菌具有高度的靶向特异性。
工程化酵母在模拟胃肠道消化中保持活性
为了评估全细胞酵母作为口服递送载体的潜力，研究者在模拟胃液和肠液中，将工程化酵母与李斯特菌在牛奶基质中共培养。经过24小时（2小时模拟胃消化，22小时模拟肠消化）后，工程化的酿酒酵母和布拉迪酵母均能比各自的野生型菌株更显著地降低李斯特菌的活菌数。这证明工程化酵母能够在一定程度上耐受胃肠道环境，并在其中释放具有活性的内溶素，发挥抗病原体作用。
S. boulardii在模拟肠道发酵中展现出抗李斯特菌潜力
在最接近真实肠道环境的实验——基于人类粪便的体外发酵模型中，结果呈现出更复杂的局面。野生型布拉迪酵母本身就表现出降低李斯特菌负荷的能力，而在两位捐赠者的粪便样本中，其效果甚至优于工程化菌株。相比之下，无论是野生型还是工程化的酿酒酵母，似乎未能有效抑制李斯特菌，在某些情况下反而可能促进了其生长。qPCR检测显示，所有测试的酵母菌株在48小时发酵期间均能保持代谢活性和生长，表明它们能够在复杂的肠道微环境中存活。
在研究结论与讨论部分，作者总结了本研究的核心发现并探讨了其意义与未来方向。本研究成功证明了利用CRISPR-Cas9技术将抗李斯特菌内溶素Ply511递送系统整合到商用益生菌布拉迪酵母中的可行性。尽管工程化布拉迪酵母在多数体外测试中表现出的抗李斯特菌活性略逊于同样改造的酿酒酵母（推测可能与表达盒最初为酿酒酵母优化、以及两菌株在糖基化模式等方面的固有差异有关），但布拉迪酵母本身作为益生菌的优势不容忽视：其对胃酸的耐受性、在37°C下生长良好的特性、已有的临床使用历史以及帮助维持肠道黏膜完整性的能力，都使其成为一个极具潜力的递送平台。
研究证实，工程化酵母及其提取物在模拟胃肠道条件下能保留活性，并在简化的肠道菌群模型中特异性抑制李斯特菌而不干扰其他共生菌，这凸显了内溶素作为“微生物组友好型”抗菌剂的潜力。这一特性使其在食品工业（如作为特定发酵食品的生物防腐剂）和预防医学（作为抗生素的辅助或替代疗法）领域具有应用前景。从监管角度看，酵母提取物等后生元（Postbiotics）产品可能比活的基因工程微生物更容易获批。
然而，在更复杂、更具竞争性的人体粪便发酵模型中，工程化酵母的抗李斯特菌增强效果并不显著。这可能是因为在营养有限、缺氧且微生物竞争激烈的真实肠道环境中，酵母的代谢活性降低，导致内溶素表达量不足以产生决定性的抗菌效果。这提示未来的研究需要进一步优化表达系统，例如开发在肠道压力条件下（如低氧、低pH）活性更强的启动子，或采用模块化工程策略（如VersaTile平台）组合不同的分泌信号、启动子和内溶素变体，以筛选出在肠道微环境中表现最优的工程菌株。
综上所述，这项研究为利用工程化益生菌递送特异性抗菌蛋白以对抗肠道病原体提供了一个概念验证平台。它不仅为解决日益严峻的抗生素耐药性问题提供了新思路，也为开发精准调控肠道微生物组、治疗特定感染的下一代生物疗法奠定了基础。随着技术的进一步优化和对宿主-微生物-工程菌相互作用的深入理解，这类“智能益生菌”有望在未来成为我们对抗感染性疾病的有力工具。
